EB病毒永生化细胞模型

《EB病毒永生化细胞模型》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EB病毒永生化细胞模型（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、EB病毒永生化细胞模型在人类疾病基因研究中的应用 朱 振 宇 教授 博士生导师中山大学 中山医学院达安基因股份有限公司 EB病毒相关人淋巴母 细胞系的蛋白质表达谱研究 国家自然基金30672358 （负责人） 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 发现 EB病毒是1964年Epstein与Barr在非洲 儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种 疱疹病毒。 1966年Old等采用免疫扩散法发现鼻 咽癌病人的血清能与非洲儿童淋巴细胞的 抽提液起反应。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据（1）： 1969年de-the从鼻咽癌活检培养的类淋 巴细胞中分离出EB病毒。 国内也已经从鼻咽癌组织培养所建立

2、的 类淋巴母细胞株中证明带有EB病毒壳抗原 （VCA）和早期抗原（EA），并在电镜下找 到了典型的疱疹病毒颗粒，其形态与EB病 毒相同。 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据（2）：Kottaridis SD等（1996年）认为鼻咽 癌患者血清中抗EBNA的水平反映肿瘤的大 小 。Anticancer Res,1996,16(2):785-789Vera-Sempere FJ等（1996年）采用巢 式PCR和免疫组化分析说明了不论组织学 类型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168 2、几乎100%鼻咽非角化性癌

3、均有EBV感染。 在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染 过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。特 别在珠江三角洲及香港地区，是世界上NPC的高 发区。 根据中山市的肿瘤统计资料（流行病学 ）， NPC的年龄和性别的校正发病率为18.12/10万 ( 男：25.60 /10万；女：11.05/10万)。97%的 NPC为非角化性癌。经EBER1原位杂交（所谓“ 金标准” ）证实癌细胞中有EBV感染。一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 小结：流行病学、血清学和分子生物学的资 料证实, EBV感染与NPC有密切关系。 鼻咽癌患者癌细胞中证实有EB病毒的DNA， 经原位杂交，多数癌细胞呈EBER

4、s阳性、核抗原 （EBNA-1）阳性。 鼻咽癌患者肿瘤细胞中有EB病毒，血清有一 套抗EB病毒的抗体，血清中的EBV抗体水平普遍 升高。 1997年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上 把EBV归类为第一类致癌物（特别是鼻咽癌） 。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中EBV抗体的不同 EBV血清学诊断利用NPC的一个特征，即 患者多种EBV抗体的水平较非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。 EBV血清学诊断已用于NPC高危人群的筛 查和对NPC可疑病例的诊断。根据从70年代后 期以来的研究结果，VCA-IgA检测通常被用于 筛查以排除NPC的诊断 ；EA-IgA检测目前

5、被用 于NPC的确定性检测。 二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中EBV抗体的不同 检测哪种抗体？ 检测抗体哪种类型？l 因为鼻咽癌（NPC）是来源于鼻咽 粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。 所 以我们可以先了解EB病毒在上皮细胞中 的潜伏感染以及两种形式的EB病毒感染 所表达的各种抗原。l 各种抗原相应产生不同的特异性抗 体中哪种有代表性？1、 EB病毒的潜伏感染上皮细胞中病毒复制循环中的B淋巴细胞池 长期潜伏感染 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 EB病毒感染口咽上皮细胞 如果感染了复制缺陷突变的病毒 待上皮细胞增生后个别细胞死亡EB病毒引自: J Immmunol. 2005; 17498

6、:4972-82、两种形式的EB病毒感染潜伏性感染(latent infection) I型潜伏性感染: 表达EBNA1，病征为 Burkitt 淋巴瘤 II型潜伏性感染:表达EBNA1和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征为Hodgkin淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤 III型潜伏性感染:表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、EBNA6，病征为传染性单核细胞增多症、移植后淋巴组织增生性疾病 溶解性感染(lytic infection)在EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小部分（约15%20%）出现溶解 性感染，溶解性感染出现三个时相（pha

7、se）。 立即早期: 表达Zta(ZEBRA)、EBNA1等早期: 表达EA(D)、EA (R) 、 EBNA1等晚期: 表达VCA、EBNA1等 EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。EBNA 1 IgA 的抗体水平 在NPC患者中高于正常的EBV携带者Cutoff OD?小结 NPC主要表现是EBV潜伏感染伴少量溶解性感 染。 EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出 现的唯一抗原。 NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞，检测上皮细 胞的分泌型IgA抗体水平对NPC较有诊断意义。 NPC的显著特征是病人血清中的EBV抗体（尤 其是IgA亚型）水平普遍升高，这种变化在N

8、PC发 病前期将先于症状出现，借此可区分NPC与其它 EB病毒感染相关疾病或健康携带者。 我们认为EBNA1/IgA抗体水平的检测对NPC高 危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段 之一。EBEB病毒在人类普遍易感病毒在人类普遍易感, ,多种疾病相关，多种疾病相关， 如传染性单核细胞增多症、如传染性单核细胞增多症、BirkittBirkitt，s s淋巴淋巴 瘤、非何杰金淋巴瘤等瘤、非何杰金淋巴瘤等体外只能感染人体外只能感染人B B淋巴细胞淋巴细胞 其致病机制仍不清楚，原因可能与其致病机制仍不清楚，原因可能与 病毒在体外对大多数细胞都不易感病毒在体外对大多数细胞都不易感 染有关染有关上皮细

9、胞内可以表现为裂解感染，上皮细胞内可以表现为裂解感染， 在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染在淋巴细胞内主要表现为潜伏感染EBEB病毒是病毒是DNADNA病毒，其基因组是线性病毒，其基因组是线性 双链双链DNADNA，长，长172Kb172Kb，由末端直接重复，由末端直接重复 序列（序列（terminal direct repeats TRterminal direct repeats TR）、）、 内部直接重复序列内部直接重复序列(internal direct (internal direct repeats IR)repeats IR)、DLDL、DRDR和重复序列之间和重复序列之间 的单一序

10、列构成的单一序列构成研究现状研究现状目前对病毒的致病机制的了解均来源目前对病毒的致病机制的了解均来源 于于EBEB病毒病毒在体外感染在体外感染B B淋巴细胞而建淋巴细胞而建 立的立的淋巴母细胞系淋巴母细胞系其致病基因主要有细胞源性基因和病其致病基因主要有细胞源性基因和病 毒的潜伏感染基因毒的潜伏感染基因EBEB病毒在病毒在B B细胞内以潜伏感染方式存在，细胞内以潜伏感染方式存在，此时，病毒基因组中只有约此时，病毒基因组中只有约9 9种基因表达种基因表达 ，编码病毒核抗原（，编码病毒核抗原（6 6种）以及潜伏膜蛋种）以及潜伏膜蛋 白（白（3 3种）和一些非信使种）和一些非信使RNARNA9 9种

11、病毒蛋白对于病毒转化细胞种病毒蛋白对于病毒转化细胞 起到必需或重要作用起到必需或重要作用不同病理组织来源的不同病理组织来源的EBEB病毒阳性病毒阳性 细胞中病毒的基因表达谱有差别（三细胞中病毒的基因表达谱有差别（三 种假说解释）种假说解释）1 1、“ “hit-and-runhit-and-run” ”：癌变早期有较多基因：癌变早期有较多基因 表达，在最终的肿瘤组织中某些基因的表达，在最终的肿瘤组织中某些基因的 表达被下调或消失表达被下调或消失2 2、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因、细胞遗传学异常取代了病毒转化基因 的表达，如在的表达，如在BurkittsBurkitts淋巴瘤中染色体移淋巴

12、瘤中染色体移 位使得位使得c-mycc-myc的表达下调的表达下调3 3、除、除B B细胞以外其他类型的细胞转化或细胞以外其他类型的细胞转化或 许需要不同的病毒基因表达谱许需要不同的病毒基因表达谱对人类基因或基因组的研究是阐 明疾病病因、发病机理，建立新型诊 断方法，并找寻有效的个体化治疗途 径的重要环节发现鉴定某些疾病相关基因的经典 路线是：提取细胞/组织的DNA或RNA ， PCR/RT-PCR后电泳，对特异性条带测序。 对于某些家族多发性疾病而言这条路线的 工作量之大是不言而喻的，因此标本的预 处理和保存就是一个不可回避的重要课题超低温冰箱和液氮都不能很好的长 期保存标本细胞永生化是一种

13、使细胞获得无限 传代能力的技术通过对细胞的适当处理使其在保留原 来细胞某些特性的前提下无限增殖。由于 可以用于长期稳定的保存疾病相关信息， 便于多年后开展回顾性对比研究，从而更 有利于对疾病的病因、发病机制的阐明， 目前该技术已广泛应用于诸如白血病、鼻 咽癌、肉瘤以及登革热等多种临床疾病的 研究 本实验室长期从事EB病毒致B 淋巴细胞永生化的研究，已经成功 建立了病毒相关人外周血淋巴细胞 永生化细胞模型并开展了相关研究 。本项目旨在通过建立稳定的携带 疾病相关信息的永生化细胞系而使珍 贵标本得以长期保存，从而为疾病相 关基因的发现和鉴定提供得力保障细胞永生化技术路线：培养B95.8细胞 收集E

14、B病毒分离外周血 淋巴细胞病毒液和淋巴细胞共培养2小时离心收集细胞RPMI1640培养约2月LCL1-5 LCL2-5 LCL3-5 LCL4-30LCL5-30LCL5-30空白对照100bp200bp300bp400bp500bp600bp2000bpmarker2000LCLs的LMP1基因 mRNA水平的检测 ,扩增片断长度 为424bp. LCL1- 5、LCL2-5 、 LCL3-5、LCL4- 30、LCL5-30都 有 LMP1基因 mRNA水平的表达 LCLsCD19LCLsCD19，CD20CD20抗体的表达抗体的表达正常外周血淋巴细胞CD19阳性率为9.6%LCLsCD1

15、9LCLsCD19，CD20CD20抗体的表达抗体的表达LCL1-5CD19阳性率为97.1%LCLsCD19LCLsCD19，CD20CD20抗体的表达抗体的表达正常外周血淋巴细胞CD20阳性率为12.2%LCLsCD19LCLsCD19，CD20CD20抗体的表达抗体的表达LCL1-5CD20阳性率为85.3%空白对照结论：LCLs细胞来源于B细胞在转化实验的初期，细胞培养瓶中 出现梭形的贴壁生长的细胞，胞体透亮 ，散在分布。实验中观察发现，这种贴 壁细胞是LCLs生长的种子，但不是每个 贴壁细胞都能长出细胞克隆，其中部分 细胞渐渐死亡。大部分文献都将这种贴 壁细胞描述为感染了EBV的淋巴母细胞 ，但尚未提出有力证据梭形的贴壁生长的细胞,胞体透亮,散在分布, 是LCLs生长的种子LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、 LCL5-30均能在软琼脂上生长形成集落 100倍5株LCLs接种在22只（不包括治疗组 ）NOD-SCID小鼠的腹腔和右侧大腿皮下 。有21只小鼠在腹腔形成了肿瘤，腹腔 肿瘤发生率达95%；有9只小鼠在大腿皮 下形成了肿瘤，