《酵母rna的提取(修改)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母rna的提取(修改)（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酵母的制备、鉴 定及含量测定结构简介二、实验原理 选材：提取和制备RNA的首要问题是选 RNA含量高的材料。微生物是工业上大量 生产核酸的原料，其中RNA的提制以酵母 最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（ 2.6710.0%），DNA很少（0.030.516 ），而且菌体容易收集，RNA也易于分 离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌 体的50%）仍具有很高的应用价值。提取 注意：所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手 指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过 程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手 套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200 （180 ）烘烤2小时以上。 RNA提制
2、过程首先要使RNA从细胞中释放，并使 它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸 在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0 2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA沉 淀。 提取方法 简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯 化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离 在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与 裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及 其它杂质彻底分离的过程。 RNARNA的的 pI2.02.5pI2.02.5 DNADNA？实验室法：苯酚法、去污剂法和盐酸胍法、 稀盐溶液提取法稀盐溶液提取法 0.14mol/L 其中苯酚法又是实验室最常
3、用的。组织匀 浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层 被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留 在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即 以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去 DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性 。 工业法：稀碱法或浓盐法RNA的鉴定 含氮碱基：嘌呤能与Ag(NH3)2+中的银结合生成 溶解度很小的嘌呤银盐沉淀，从而鉴定嘌呤的存 在。 戊糖：核糖与强酸共热生成糠醛，后者与地衣酚 (3，5二硝基甲苯)反应，缩合成绿色化合物， 以此鉴定戊糖的存在。 磷酸：在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸 。后者当有还原刑(如抗杯血酸、氯化亚锡等)存 在时，立即转变成蓝色的还原产物。钼蓝反应极
4、 为灵敏，微量杂质的磷、硅酸盐、铁离子以及强 度偏高或偏低都会影响测定结果。因此实验用的 器皿需要特别清洁。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料 干酵母粉、pH0.55.0的精密试纸；冰块。 2主要仪器 （1）药物天平（2）三角瓶（100mL）（3）量筒（ 50mL）（4）水浴锅（5）电炉 （6）试管木夹（7）离心管（8）离心机（4 000r/min）（9）烧杯（250mL, 50mL, 10mL）（ 10）滴管及玻棒（11）吸滤瓶（500mL）（12） 布氏漏斗（60mm）（13）表面皿（8cm）（14） 烘箱（15）干燥器（16）紫外可见分光光度计 1、试剂1.5mol/l硫酸溶液、地衣
5、酚试剂、 1%AgNO3溶液、浓氨水、等四、操作方法（一）、RNA的制备1提取 活性干酵母粉5g，倒入100mL三角瓶中，加 NaCl 5g，水50mL，搅拌均匀，置于沸水 浴中提取1h。 2分离 将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装 入大离心管内，以3 500r/min离心10min， 使提取液与菌体残渣等分离。 3沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯中，并 置于放有冰块的250mL烧杯中冷却，待冷至 10以下时，用6mol/L HCl小心地调节pH 至2.02.5。随着pH下降，溶液中白色沉淀 逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意 严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置 10m
6、in，使沉淀充分，颗粒变大。 4抽滤和洗涤 上述悬浮液以3 000r/min离心10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在10mL小烧杯内， 用95的乙醇510mL充分搅拌洗涤，然后 在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵 抽气过滤，再用95乙醇510mL淋洗3次 。由于RNA不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水 ，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且 可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高 了制品的纯度。 5干燥 从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在 8cm表面皿上，置于80烘箱内干燥。将干 燥后的RNA制品称重。（二）RNA的鉴定 水解RNA：取0.51g提取的核酸，加入10%硫酸 10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行 组份鉴定。 1、取冷却后的RNA水解液0.5ml，加入0.5ml的 浓氨水，再加入1ml1%的AgNO3溶液，观察有无 沉淀生成。 2、取RNA水解液1ml，加入1ml 地衣酚溶液，于 沸水浴中加热15分钟，观察溶液颜色的变化。 （3）磷酸：取一支试管，加入2mL水解液，然 后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后，在沸水 浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。
