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1、酵母的制备、鉴 定及含量测定结构简介二、实验原理 选材:提取和制备RNA的首要问题是选 RNA含量高的材料。微生物是工业上大量 生产核酸的原料,其中RNA的提制以酵母 最为理想,因为酵母核酸中主要是RNA( 2.6710.0%),DNA很少(0.030.516 ),而且菌体容易收集,RNA也易于分 离。此外,抽提后的菌体蛋白质(占干菌 体的50%)仍具有很高的应用价值。提取 注意:所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手 指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过 程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手 套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200 (180 )烘烤2小时以上。 RNA提制
2、过程首先要使RNA从细胞中释放,并使 它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸 在等电点时溶解度最小的性质,将pH调至2.0 2.5,使RNA沉淀,进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性,以乙醇洗涤RNA沉 淀。 提取方法 简单地讲,核酸抽提包含样品的裂解和纯 化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离 在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与 裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及 其它杂质彻底分离的过程。 RNARNA的的 pI2.02.5pI2.02.5 DNADNA?实验室法:苯酚法、去污剂法和盐酸胍法、 稀盐溶液提取法稀盐溶液提取法 0.14mol/L 其中苯酚法又是实验室最常
3、用的。组织匀 浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层 被苯酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留 在苯酚层中,向水层加入乙醇后,RNA即 以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去 DNA和蛋白质,提取的RNA具有生物活性 。 工业法:稀碱法或浓盐法RNA的鉴定 含氮碱基:嘌呤能与Ag(NH3)2+中的银结合生成 溶解度很小的嘌呤银盐沉淀,从而鉴定嘌呤的存 在。 戊糖:核糖与强酸共热生成糠醛,后者与地衣酚 (3,5二硝基甲苯)反应,缩合成绿色化合物, 以此鉴定戊糖的存在。 磷酸:在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸 。后者当有还原刑(如抗杯血酸、氯化亚锡等)存 在时,立即转变成蓝色的还原产物。钼蓝反应极
4、 为灵敏,微量杂质的磷、硅酸盐、铁离子以及强 度偏高或偏低都会影响测定结果。因此实验用的 器皿需要特别清洁。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料 干酵母粉、pH0.55.0的精密试纸;冰块。 2主要仪器 (1)药物天平(2)三角瓶(100mL)(3)量筒( 50mL)(4)水浴锅(5)电炉 (6)试管木夹(7)离心管(8)离心机(4 000r/min)(9)烧杯(250mL, 50mL, 10mL)( 10)滴管及玻棒(11)吸滤瓶(500mL)(12) 布氏漏斗(60mm)(13)表面皿(8cm)(14) 烘箱(15)干燥器(16)紫外可见分光光度计 1、试剂1.5mol/l硫酸溶液、地衣
5、酚试剂、 1%AgNO3溶液、浓氨水、等四、操作方法(一)、RNA的制备1提取 活性干酵母粉5g,倒入100mL三角瓶中,加 NaCl 5g,水50mL,搅拌均匀,置于沸水 浴中提取1h。 2分离 将上述提取液取出,立即用自来水冷却,装 入大离心管内,以3 500r/min离心10min, 使提取液与菌体残渣等分离。 3沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯中,并 置于放有冰块的250mL烧杯中冷却,待冷至 10以下时,用6mol/L HCl小心地调节pH 至2.02.5。随着pH下降,溶液中白色沉淀 逐渐增加,到等电点时沉淀量最多(注意 严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置 10m
6、in,使沉淀充分,颗粒变大。 4抽滤和洗涤 上述悬浮液以3 000r/min离心10min,得到 RNA沉淀。将沉淀物放在10mL小烧杯内, 用95的乙醇510mL充分搅拌洗涤,然后 在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空泵 抽气过滤,再用95乙醇510mL淋洗3次 。由于RNA不溶于乙醇,洗涤不仅可脱水 ,使沉淀物疏松,便于过滤、干燥,而且 可除去可溶性的脂类及色素等杂质,提高 了制品的纯度。 5干燥 从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸,放在 8cm表面皿上,置于80烘箱内干燥。将干 燥后的RNA制品称重。(二)RNA的鉴定 水解RNA:取0.51g提取的核酸,加入10%硫酸 10mL沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行 组份鉴定。 1、取冷却后的RNA水解液0.5ml,加入0.5ml的 浓氨水,再加入1ml1%的AgNO3溶液,观察有无 沉淀生成。 2、取RNA水解液1ml,加入1ml 地衣酚溶液,于 沸水浴中加热15分钟,观察溶液颜色的变化。 (3)磷酸:取一支试管,加入2mL水解液,然 后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后,在沸水 浴中加热,观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。