《酵母双杂交(自激活)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母双杂交(自激活)（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酵母双杂交(自激活)真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。一、原理酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由 147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。AD则能激活UAS下游的基因进行转录。单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的
2、转录激活功能。His, -gal一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。His, -gal自激活原理Transcription factorsGAL4BDYPDA液体 500ml固体 100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g琼脂2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培养
3、基0.2g ade定容至 100ml 0.2%的ade母液pH 6.5 灭菌 121 15min正对照：pGAL4负对照： pBD-GAL41. 将-70下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30培养2-3天。2. 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30培养18-24hr。3. 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养12hr，若还不到，换单克隆重摇。4. 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30，2
4、30rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.40.6。5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。6. 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。7. 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1TE/LiAc重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。酵母菌株感受态细胞制备：酵母转化1. 鲑鱼精 DNA（20g/l）沸水中煮20min，冰上冷却10min。2. 加入100l酵母感受态细胞、12l构建质粒（约200ng）、100g鲑鱼精、600l TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s1mi
5、n至混匀。3. 30，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。4. 加入70l DMSO，温和颠倒混匀。5. 42水浴热休克15min，后冰浴10min。6. 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1TE重悬细胞。（ 1TE室温只能放置12hr）7. 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30倒置培养约3-5天，直至出现菌落。阳性克隆的筛选：将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培养基上进行筛选。30培养2天，检查生长情况。对生长状态较好的单克隆进行-半乳糖苷酶活性分析。-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析）1. 取2ml的Z缓冲液/X- gal溶液润透2张滤纸；2. 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气 泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；3. 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸， 沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次；4. 沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸 上，同时吸掉多余的Z缓冲液/X-gal溶液；5. 沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30温箱3-8h，观察酵母的颜色变化。
