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1、 第四章 药物定量分析与分析方法验证 第一节 定量分析样品的前处理方法 第二节 定量分析方法特点第三节 药品质量标准分析方法验证第四节 生物样品分析方法的基本要求返回主目录基本要求练习与思考基本要求一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展 及在药物分中的应用。返 回第一节 定量分析样品的前处理方法一、概述1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？含卤素有机药物 R-X （F，Cl, Br, I ）金属有机药物 R-O-Me（有机酸或酚的 含金属有机药物 金属盐；结合不牢固）有机金属药物 R-Me （结合牢固） 2. 常用的处理方
2、法 不经有机破坏的分析方法药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法二、不经有机破坏的分析方法 （一）直接测定法例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采用铈量法 ，邻二氮菲作指示剂 （二）经水解后测定法1. 直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2ONaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH
3、 H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O （三）经氧化还原后测定法1. 碱性还原后测定 例如：泛影酸的含量测定2. 酸性还原后测定 例如：碘番酸的含量测定 Zn还原后银量法 3. 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 （2）含铁药物2Fe3+ + 2KI 2Fe2+ + 2K+ + I2I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6H+三、经有机破坏的分析方法 湿法破坏药物分析中常用的有机破坏的方法有 干法破坏HN
4、O3-HClO4法 氧瓶燃烧法(一)湿法破坏 HNO3-H2SO4法H2SO4-硫酸盐法HNO3- H2SO4-HClO4法； H2SO4-H2O2； H2SO4-KMnO4(二)干法破坏 加Na2CO3或MgO以助灰化；温度控制在420 (三)氧燃瓶燃烧法(oxygen flask combustion method)1. 仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质玻璃锥形瓶2. 称样 固体样；液体样要求详见P683. 燃烧分解操作法4. 吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.应用示例
5、：碘苯酯的测定返 回第二节 定量分析方法特点一、容量分析法（一）容量分析法的特点操作简单、快速；比较准确（RSD0.2%）；仪器普通易得。（二）容量分析法的计算问题1. 滴定度（T）的概念 每1mlmol溶液相当于被测物质的量(mg)2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dDT = Mb/aB3. 百分含量的计算（1）直接滴定法 D% = V F T/W 100%F = 实际标定的浓度/规定的浓度 （2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D% = （VO VB) F T/W 100%二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7
6、g/ml 1. 特点 准确度高，SRD（%）为2% 5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用 范围广。2. 朗伯-比耳定律 A = ECL E1%1cm = 10/M3. 仪器校正和检定波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml波长(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大)E1%
7、1cm 124.5 144.0 48.62 106.6杂散光检查： 试剂 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%)NaI 1.00 220nm 0.8NaNO2 5.00 340nm 0.84. 对溶剂的要求:220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上溶剂+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.055. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=CxD/W100 %常用方法 吸收系数法： 含量%= (E1%1cm )x/(E1%1cm )r 100 %计算分光光度法：VA的三点校正法（二）荧光分光光度法灵敏度
8、高，可达10-10g/ml 10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用 1. 特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。2. 荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3. 含量测定 常用的方法对照品比较法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) CrCh.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。三、色谱分析法按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱方法分类按分离方法分为：PC；TLC；柱色
9、谱；GC；HPLC 。（一）HPLC法1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)22. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量 3. 测定方法 标准曲线法外标法测定供试品中主成分含量外标一点法 应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法（二）GC法1. 对GC仪器一般要求 载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱色谱柱的
10、理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)22. 系统性试验 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.9 1.05 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法 标准曲线法外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。返 回第三节 药品质量标准分析方法验证一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测
11、定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率的RSD2%；用UV和HPLC发时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%（二）数据要求回收率% = （测定平均值 空白值）/加入量100%要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。二、精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。（一）精密度表示方法1.
12、偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X2. 标准偏差（standard deviation, SD或S）S =(Xi X)2/(n-1)1/23. 相对标准差(relative standard deviation, RSD)也称变异系数(coefficient of variation, CV)RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%（二）重复性、中间精密度及重现性1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测
13、定结果的精密度。（三）数据要求应报告S或SD、RSD和可信限。用统计学的可信性分析(t或f）。三、专属性是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下 ，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性 。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。四、检测限（limit of detection, LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可 。（一）常用的方法1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法 UV法：LOD = f.3S空 = C样/A样 3S空Flu法：LOD = f.3S空 = C样/(F样-F空) 3S空GC和HPLC法：
