病毒学- 病毒的检验

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1、第四节第四节 病毒的检验病毒的检验goodgood常用的病毒检验方法包括：一、病毒的分离鉴定一、病毒的分离鉴定二、病毒感染性的检测二、病毒感染性的检测三、病毒颗粒检测三、病毒颗粒检测四、病毒的血清学检查四、病毒的血清学检查五、病毒的分子五、病毒的分子( (蛋白和核酸蛋白和核酸) )检测检测一、病毒的分离鉴定一、病毒的分离鉴定n n 病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。研究提供材料。n n 病毒的分离和鉴定（含义）病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带：指从病人、

2、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, , 采用一系列物理、化学、生物学等手段采用一系列物理、化学、生物学等手段, ,将病将病 毒从标本中分离出来毒从标本中分离出来, ,并通过有关特异性方法并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒鉴定属于何种病毒, ,这一方法称为病毒的分离这一方法称为病毒的分离 与鉴定。与鉴定。病毒的分离与鉴定包括：病毒的分离与鉴定包括：n n1 1、病毒材料的采集与准备、病毒材料的采集与准备 2 2、病毒的、病毒的分离与培养分离与培养33、病毒的形态学观察、病毒的形态学观察44、病毒的理化特性测定、病毒的理化特性测定55、病毒的血、

3、病毒的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。本过程。（一）标本的采取与送检（一）标本的采取与送检n n 病料采集适当与否病料采集适当与否, ,直接影响病毒的检测结果。直接影响病毒的检测结果。n n 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等物或粪便等, ,主要因动物及病毒的种类而异主要因动物及病毒的种类而异, ,n n 例如检测犬细小病毒或轮状病毒例如检测犬细小病毒或轮状病毒, ,一般应采腹泻一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便幼犬或犊牛的粪便; ;n n 怀疑为口蹄疫的猪或牛怀疑为口蹄疫的猪或牛, ,则应采其

4、水疱液及水疱则应采其水疱液及水疱 皮送检。皮送检。应注意下列原则：应注意下列原则：n n 1. 1.对本身带有杂菌对本身带有杂菌 ( (如咽喉拭子、粪便如咽喉拭子、粪便) ) 或易或易 受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应 使用使用抗生素抗生素。 n n 2. 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应因病毒在室温中易失去活性，标本应低温低温 保存并尽快送检。保存并尽快送检。 n n 3. 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病血清学诊断标本的采取应在发病初期和病 后后2 23w3w内各取内各取1 1份血清，以便份血清，以便对比对比双份血清双份血清 抗体效价

5、的动态变化。抗体效价的动态变化。标本处理：标本处理：n n 采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前, ,都需要做适都需要做适 当的处理当的处理, ,以保证病毒分离的成功几率。以保证病毒分离的成功几率。n n 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等结等, ,可取一小块进行可取一小块进行充分研磨充分研磨, ,加入含青、链霉素的加入含青、链霉素的 HanksHanks液液, ,离心取上清液作为接种物离心取上清液作为接种物; ;n n 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,

6、 ,应加入应加入 高浓度的高浓度的抗生素抗生素, ,充分混匀后充分混匀后, ,置置4 4冰箱内处理冰箱内处理24h24h 或过夜或过夜, ,离心后取上清做接种用离心后取上清做接种用; ;n n 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%2%小牛血小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的清和一定浓度的青、链霉素的HanksHanks液中液中, ,充分刷洗充分刷洗 棉拭子棉拭子, ,反复冻融反复冻融3535次次, ,离心后取上清液作为接种材料离心后取上清液作为接种材料 。（二）病毒的分离与培养n n 细胞培养、鸡胚和实验动物细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养

7、可用于病毒的分离与培养 , ,其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法 。n n 用于病毒分离与培养的细胞有用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞原代细胞、二倍体细胞 株和传代细胞系株和传代细胞系, ,一般说来一般说来, ,本动物的原代细胞最为敏本动物的原代细胞最为敏 感感, ,但不如传代细胞方便易得但不如传代细胞方便易得. .n n 例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原 代或二倍体细胞代或二倍体细胞, ,但该细胞生长缓慢但该细胞生长缓慢, ,通常用通常用PD5(PD5(猪甲猪甲 状

8、腺细胞系状腺细胞系) )取代。取代。n n 培养方法常用的有培养方法常用的有静置培养和旋转培养静置培养和旋转培养, ,有的病毒如有的病毒如 轮状病毒轮状病毒, ,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养初次分离时旋转培养的成功率较静置培养 高。高。1、病毒的分离n n 不同的病毒分离时采用不同的分离方法不同的病毒分离时采用不同的分离方法, ,这主这主 要取决于目的要取决于目的病毒的生物学特性病毒的生物学特性。n n 主要有主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种 法法等等, ,而对细胞、鸡胚不敏感而对细胞、鸡胚不敏感, ,又没有合适动物又没有合适动物 模型的病毒模型的

9、病毒, ,可采用可采用基因克隆基因克隆的方法。的方法。（1）动物接种法n n 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类 不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内 ，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。 n n 动物的接种途径要根据动物的接种途径要根据病毒种类病毒种类、实验动物实验动物 种类种类、接种材料接种材料等选择合适的接种途径。动等选择合适的接种途径。动 物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离物接种途径的选择正确与否对提

10、高病毒分离 成功率也起到重要作用。成功率也起到重要作用。常见病毒常用实验动物及接种途径P37P37n n 在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特 异性抗体。异性抗体。n n 实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。n n 致死性采血致死性采血是指尽量采集动物血是指尽量采集动物血, ,直至动物死亡。直至动物死亡。n n 非致死性采血非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡是指采集一定量的动物血而不致动物死亡 。n n 对采血动物对采血动物, ,应在禁食应在禁食24h24h后采血。

11、采血应无菌操作。后采血。采血应无菌操作。n n 不同动物采用不同的采血方法。常用的有不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏心脏采血法、采血法、 眼眶眼眶采血法、采血法、颈静脉颈静脉采血法、采血法、颈动脉颈动脉采血法、采血法、耳静脉耳静脉采采 血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。实验动物采血n n 鸡胚对多种病毒敏感。鸡胚对多种病毒敏感。n n 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大很大, ,因此选择适当的接种途径是病毒分离成因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。功的关键。n n 一般采用孵化一般采

12、用孵化9 91414天的鸡胚，根据病毒种类天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、尿囊腔、绒毛尿绒毛尿 囊膜囊膜、卵黄囊卵黄囊和和羊膜腔羊膜腔等。等。（2）鸡胚培养法n n 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培 养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用 的基本方法。的基本方法。（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture) n n 一般选择一般选择生长旺

13、盛生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离的敏感细胞用于病毒分离 。n n 少数病毒例外少数病毒例外, ,例如犬、猪等的细小病毒例如犬、猪等的细小病毒, ,病毒病毒 的复制有赖于的复制有赖于分裂旺盛分裂旺盛的细胞的细胞, ,因此需将病毒因此需将病毒 接种与细胞培养接种与细胞培养同步同步进行。进行。n n 细胞培养技术在病毒细胞培养技术在病毒发现发现、病毒研究、疫苗、病毒研究、疫苗 研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程 中发挥着重要作用。中发挥着重要作用。常见人类病毒的敏感细胞P36P36P36P36（4）分子生物学技术n n 对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病

14、对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病 毒毒, ,可采用现代分子生物学技术可采用现代分子生物学技术, ,如基因克隆技如基因克隆技 术术, ,对病毒的全基因进行克隆对病毒的全基因进行克隆, ,构建表达载体构建表达载体, , 并能表达出病毒样颗粒。并能表达出病毒样颗粒。（三）病毒的鉴定步骤：步骤：1 1、初步鉴定、初步鉴定2 2、接种动物的观察、接种动物的观察3 3、最终鉴定、最终鉴定1、初步鉴定(1)(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。根据临床表现、流行病学特征与标本来源。 初步判定属于哪一类病毒初步判定属于哪一类病毒n n 脑炎患者脑炎患者脑脊液脑脊液 乙型脑炎病毒乙型脑炎病毒n n

15、秋季腹泻病人秋季腹泻病人粪便粪便轮状病毒轮状病毒n n 发烧小孩（下肢麻痹）发烧小孩（下肢麻痹）粪便粪便脊髓灰质炎脊髓灰质炎 病毒病毒(2)病毒的生物学特性病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上, ,出现细胞融合出现细胞融合, , 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病

16、毒、流感病毒等；接种到肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。细胞病变效应哪三种现象？血吸附和血凝作用n n 有些病毒感染细胞后有些病毒感染细胞后, ,细胞膜上可镶嵌着病毒细胞膜上可镶嵌着病毒 基因编码产生的糖蛋白基因编码产生的糖蛋白, ,其中有些能吸附特定其中有些能吸附特定 种类的红细胞种类的红细胞, ,或将细胞培养单层刮下后或将细胞培养单层刮下后, ,经过经过 适当处理适当处理, ,可以凝集特定种类的红细胞可以凝集特定种类的红细胞, ,此类糖此类糖 蛋白在细胞表面形成刺突蛋