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1、梅毒的实验室检测技术 及进展n梅毒概述n实验室检测技术及临床意义n梅毒实验室检测策略探讨主要内容梅毒概述梅毒起源于美洲，然后从美洲到西班牙，从欧洲到亚洲印 度，1505年从印度传入广东岭南（“广东疮”），后传到全 国各地。少数民族地区居民梅毒感染率 = 10%牧区人群梅毒感染率 = 48%部分城市地区人群梅毒感染率 = 5%部分农村地区人群梅毒感染率 = 2-3%（此幻灯片内容源自中国疾病预防控制中心性病控制中心陈祥生教授）我国梅毒流行的历史-经济繁荣的附带品51350万我国根据2011年全国HIV哨点监测 患病率结果进行初步估计：我国梅毒疾病负担占全球的比重？我国占全球8%，亚太地区22%，
2、是西太区平均水平的2倍STD epi & control - Chen XS我国梅毒报告疫情趋势7梅毒报告病例数444,952例，甲乙类传染病第3位淋病报告病例数103,085例，甲乙类传染病第6位2013年全国梅毒、淋病病例报告82011年全国HIV哨点监测资料(NCAIDS)我国的梅毒在哪里？9重点人群中的梅毒高危人群？10我国预防与控制梅毒规划卫生部2010年6月下发中国预防与控制梅 毒规划（2010-2020年）STD epi & control - Chen XS实验室检测技术及临床意义下列说法是否正确？二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验100阳性RPR只能用于梅毒初筛RPR
3、滴度应在1：8以上才能作为诊断隐性梅毒，梅毒血液标本的核酸检测阴性，表明无梅毒螺旋体感染接受抗梅治疗的婴儿，随访18个月后TPPA试验阳性，RPR试验阴性可确诊为胎传梅毒-12常用梅毒实验室检测方法n病原学检测n血清学检测病原学检查n原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。n方法：（1）暗视显微镜检查（2）镀银染色法（3）核酸检测（血液标本？）注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功，仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。病原
4、学检查n不同标本核酸检测研究初步结果：皮损部位标本：阳性率85%血浆标本阳性率：0%全血标本： 一期梅毒阳性率：0%二期梅毒阳性率：36%隐性梅毒阳性率：20%：病原学检查的临床意义n螺旋体检查是诊断早期梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。n如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。梅毒血清学检测方法(1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）(2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）两类方法。问题：问题：为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法 ？非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n梅
5、毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。n未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。问题：问题：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需要做定性和定量两种检测方法？要做定性和定量两种检测方法？非梅毒螺旋体抗原血清学原理n方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验 (VDRL)等。n基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇n抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉
6、 眼所见n上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪，转速？转幅？ 2、定性试验n加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原n反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 -29 ） ，亮光下观察结果？滴/mL，1滴=？ul非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪，转速、转幅 2、定性试验n加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原n反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 -
7、29 ） ，亮光下观察结果60滴/mL，1滴=17ul100r/min 约18mm非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验n稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开n加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。n 下同定性试验。？1:21:41:81:161:321:641:2561:1281:512定量试验结果判断血清稀释度结果？1:21:41:81:16+-？+-？+-？问题：定量试验原倍血清滴度是多少？问题：定量试验原倍血清滴度是多少？问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？TRUS
8、T 1:16非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断RPR 1:2561:11:21:41:81:161:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:321:641:1281:2561:512非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后n 一期梅毒1年后转为阴性n 二期梅毒2年后转为阴性。n 晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义n非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。n因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复
9、发或再感染的指征。nVDRL试验用于神经梅毒脑脊液检测特异性高，检测阳性可以作为神经梅毒确诊依据，但敏感性较低，即检测阴性不能排除神经梅毒。梅毒 病期敏感性 (%)特异性 (%)一期86（77-99）-二期100隐性98(95-100) （一般滴度1:8， 但不排除1:8）晚期73非梅 毒-98(93- 99)非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点假阳性反应n技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。n生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重 组特异抗
10、原），检测梅毒患者血中特异性抗 梅毒螺旋体抗原的抗体。n感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？在梅毒诊疗中有意义吗？梅毒螺旋体抗原血清学试验方法n梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA)n 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA)n 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）n 化学发光免疫分析法（CLIA）n 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT)n 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）n梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPAnTPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅
11、毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。n TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。+明胶颗颗粒梅毒抗原+抗原致敏颗颗粒抗原致敏颗颗粒血液中抗体抗原抗体凝集TPPA试验原理示意图324+： 粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠 3+： 粒子光滑覆盖大部分底 2+：粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周围有一明显细胞环 ： 粒子沉集孔底，中央形成一小点 ： 粒子紧密沉积孔底中央 TPPA试验结果判读敏感性特异性病期一 期二 期隐 性临床试验a100100100美国CDC8810010095a
12、:均为RPR阳性标本ELISA/ CLIAnELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。n本法可用于大样本血清检测。化学发光法的临床应用意义基本同ELISA化学发光法的敏感性？梅毒免疫层析快速检测方法（全血法）34梅毒免疫层析快速检测方法（血清、血浆法）梅毒螺旋体蛋白 印迹试验（WB）荧光螺旋体抗体吸收 试验（FTA-ABS）梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义n作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验，排除RPR 假阳性。n不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗
13、原血清试验结果进行诊断。n梅毒螺旋体抗原血清试验不能作为疗效观察的指标。非梅毒螺旋体抗原血清试验结果解释示意图早期晚期一期二期早期潜伏晚期潜伏三期治疗前 治疗后 阳性阴性梅毒螺旋体抗原血清试验结果解释示意图早期一期 二期早期潜伏晚期晚期潜伏三期治疗前 治疗后阳性阴性梅毒血清学试验结果解释（梅毒临床诊断参考依据）41试验结果参考结果解释*梅毒螺旋体抗原血清试验非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性阳性可能为现症梅毒阴性阳性非梅毒螺旋体血清试验假阳性阳性阴性临床治愈的早期梅毒（既往感染者）或极早期梅毒阴性阴性排除梅毒感染或极早期梅毒问题问题 ：此结结果解释释适用于先天（胎传传）梅毒吗吗？先天（胎传）梅毒的实
14、验室诊断依据n查到螺旋体n其抗心磷脂抗体滴度持续上升n其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度）n检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性n随访18个月观察抗体的变化（哪一类抗体？）预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方案 问题问题 ：IgG抗体和IgM抗体有什么区别别？梅毒IgM抗体（TP-IgM）IgM抗体的产生是感染后的早期体液免疫应答反应。IgM分子比IgG较大，所以IgM抗体不能通过胎盘屏障。而母亲的IgG抗体可以通过胎盘屏障传给胎儿。因此若在新生儿血中检测到IgG抗体不能作为先天梅毒的诊断依据，而IgM抗体可为先天梅毒的诊断依据。IgM抗体检测其特异性较高，但敏感性较低。因此，Ig
15、M抗体检测阴性，不能排除先天梅毒感染。43先天（胎传）梅毒的实验室诊断依据n查到螺旋体n其抗心磷脂抗体滴度持续上升n其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度）n检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性n随访18个月观察抗体的变化（特异性抗体）梅毒实验室检测策略探讨梅毒实验室检测策略思考46非梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验n排除试验假阳性n确证梅毒螺旋体现症感染n排除治愈的既往感染者n确证梅毒螺旋体现症感染？RPR：初筛试验 TPPA：确证试验梅毒实验室检测策略思考方法选择依据n敏感性、特异性（试剂评估）n操作流程（可及性）n试剂的价格、结果时间（可接收性）47？初筛目的和方法选择规范化梅毒实验室检测要求n根据目的选择检测方法及检测策略。n可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。49非梅毒螺旋体抗原血清试验快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验 (VDRL)血清学检测试剂的种类梅毒螺旋体抗原血清试验梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分
