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1、2010级本科分子 生物学实验设计案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院 。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐 、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患 者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38(37.2 ），脉搏150次/ 分（75次/ 分），呼吸40次/分（20次/分），血 压80/60mmHg（100120/ 6080mmHg ），呼 吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄 染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、 脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及 异常。实验室检查： 红细胞 1.981012/L(新生儿:6.01012/L) 血红蛋白 53g/L
2、(儿童：110160g/L) 血清总胆红 85.5mol/L（3.411.7mol/L） 结合胆红素 13.7mol/L 未结合胆红素71.8mol/L 尿蛋白（+） 潜血(+) 尿胆红素() 尿 胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症 （俗称“蚕豆病”）初步诊断 发病机理 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD） 有遗传缺陷者在食用青鲜蚕豆或接触蚕豆花 粉后皆会发生急性溶血性贫血症蚕豆病 ，致病机制尚未十分明了。已知有遗传缺陷 的敏感红细胞，因G6PD的缺陷不能提供足 够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH ）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中 某种因子后更诱发了
3、红细胞膜被氧化，红细 胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生 成过氧化脂质，损害细胞膜。G-6-PD有保 护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕 豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红 细胞被破坏而致病。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 比值法实验名称：6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖脱氢酶NADP+NADPH+ +H+ 6-磷酸葡萄糖酸NADP+NADPH+ +H+6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶5-磷酸核酮糖【原理】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄 糖酸。红细胞溶解的溶血素中存在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，可 催化生成的6-磷酸葡萄糖酸进一步转化为5-磷酸核糖
4、，这两步 伴有NADP+还原为NADPH，通过NADP+ 还原为NADPH的速 率与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性成比例。由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子的葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶活性的范围较宽，用以上的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性定量测 定方法来检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子，检出率较低。 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶缺乏极其罕见，其浓度和活性一般较稳 定。因此在一般情况下，通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷 酸葡糖糖酸脱氢酶活性来计算葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/6-磷酸葡糖 糖酸脱氢酶比值，可以提高对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏杂合子 的检出率。 【试剂】 溶血素；1mol/LTris-盐酸
5、缓冲液(含5mmol/L EDTA)，pH8.0；2mmol/L NADP溶液，蒸馏水， 0.1mmol/L 氯化镁溶液；6mmol/L葡萄糖-6-磷酸溶液；6mmol/L 6-磷酸葡 萄糖酸溶液。 【仪器】移液器,比色皿，紫外可见分光光度计，1ml试管【操作方法】 （1）溶血素制备：红细胞酶活性测定用的溶血素为比容 红细胞1体积溶于溶液19体积中。溶血素须新鲜配制 ，在4存放不宜超过8小时。（2）酶活性测定操作：本测定系统包括了主要测定葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶活性（测定1）；测定6-磷酸葡萄糖 酸脱氢酶活性（测定2）和测定葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的总活性（测定3）3个
6、 方面。在1ml的测定系统中，试剂的浓度及用量及 检测步骤：一对照管为基准，37恒温，340nm记 录各测定管得吸光度变化（A）10分钟。如检查系 统1ml，各试剂的用量应该按比例增加。试剂对照测定1测定2测定31mol/LTris-盐酸缓 冲液(含5mmol/L EDTA，pH8.0)1001001001002mmol/L NADP溶液1001001001000.1mmol/L 氯化镁溶 液1001001001001:20溶血素20202020蒸馏水6805805805806mmol/L葡萄糖- 6- 磷酸溶液_100_1006mmol/L 6-磷酸葡 萄糖酸溶液_100100【计算结果】葡
7、萄糖-6-磷酸脱氢酶活性IU/(2.81010)=（A/2.8）1010115.8.式中，A为测定的吸光度变化值；Hb为血红蛋白浓度；115.8为根据本测定方法反应体系的总量，溶血素所含红细胞数量和NADPH的吸光系数，以每分钟的吸光度变化酶活性计算公式换算出的系数 注意事项 操作过程中，注意试剂量的准确度，保持相同的 酸碱度。 反应试剂须使用前新鲜配制。 【正常参考值】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/6-磷酸葡萄 糖酸脱氢酶比值0.95.若34.2umol/L时 ，黄疸血清总胆红素 结合胆红素变化不大（水溶性 大，随尿排出）未结合胆红素（水溶性 小，不能随尿排出，有毒）酱油尿G-6-PD是红细胞葡萄
8、糖磷酸戊糖旁路代谢中所必须的脱 氢酶，它使6-磷酸葡萄糖释放H+，从而使辅酶（NADP） 还原成还原型辅酶（NADPH）.NADPH是红细胞抗氧化的 重要物质，它能使细胞内的氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原 成还原型的谷胱甘肽（GSH）和维持过氧化氢酶（CAT）的 活性（如图）。CAT是过氧化氢（H2O2）还原成H2O的还原 酶。GSH的重要作用是： 保护红细胞内含硫氰基（-SH）的 血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，避免H2O2对含-SH基 物质的氧化 与谷胱甘肽过氧化酶（GSHpx）共同使H2O2 还原成H2O，G-6-PD缺乏时，NADPH生成不足，CAT和 GSH减少，因此，当机体受到氧化物侵害时作用产生的H2O2 不能被及时还原成H2O，过多的H2O2作用于含-SH基的血红蛋 白、膜蛋白和酶蛋白，致血红蛋白和膜蛋白均发生氧化损伤 。血红蛋白氧化成交铁血红蛋白和变形珠蛋白小体，红细胞 膜的过氧化损伤则致膜脂质和膜蛋白硫基的氧化。上述作用 最终造成红细胞膜的氧化损伤和溶血。体型体型瘦小与该疾病是否有关，为什么？核酸（DNA,RNA）受影响蛋白质合成与表达受限营养不良某些肽类激素（如甲状腺激素 ，生长激素）NADPH脂肪酸合成瘦弱吞噬细胞的免疫作用体弱多病（1）5-磷酸核糖有一定关系（2）其他因素营养摄入不足，不均衡父母遗传缺乏运动
