基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制

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1、重组基因工程药物的分离重组基因工程药物的分离 纯化及质量控制纯化及质量控制基因工程药物制造的一般流程：基因工程药物制造的一般流程： （1 1）获得目的基因；）获得目的基因； （2 2） 组建重组质粒；组建重组质粒； （3 3）构建基因工程菌；）构建基因工程菌； （4 4）培养工程菌；）培养工程菌； （5 5）产物分离纯化；）产物分离纯化； （6 6）除菌过滤；）除菌过滤； （7 7）半成品检定；）半成品检定； （8 8）包装）包装基因工程药物特点:(1) 目的产物在初始原料中的含量较低;(2) 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特 别是产

2、物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；(3) 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；(4) 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；(5) 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理 化性质和生物学特性来决定。产 物 特 性 作 用等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及

3、蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间建立分离纯化工艺的根据建立分离纯化工艺的根据1、含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种

4、类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。特别

5、注意3类可能存在的非蛋白质类杂质：（1）DNA的去除：在利用离子交换时，控制样液的pH 值，使DNA不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲 和层析；（2）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。 病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离 ，一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射 使病毒失活，或用过滤法将病毒去除。（2）热原的去除：热原主要是肠科杆菌科所产生的 细胞内毒素，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来， 主要是细胞壁成份脂多糖，其性质相当稳定，即使 经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。 从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是 防止产生热原，整个生产过程要在无菌条件下进行，

6、 所有层析介质在使用前都要先除去热原，在28下 进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质 溶液也应无菌处理，即经过0.2m滤膜过滤。 脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏 水的，也可以用疏水层析法。基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产 物胞外产 物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变 性复 性浓 缩初步分离 高度纯化制 剂产 品A A 重组重组基因工程药物基因工程药物分离纯化方法选择分离纯化方法选择 的基因原则的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层

7、析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大 、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等 方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达 重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选用 亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间 的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理 ，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同

8、的层析类型等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组 蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去 几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都 是亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标 蛋白之间的解离常数应合适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一 体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出 极大的优越性。疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差 异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体 积差异进行分离的；多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合

9、使用 多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵 循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安 排在最后阶段合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和 Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在 大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞

10、壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生 产工艺。比较指标表 达 系 统大肠杆菌酵 母 菌哺乳动物细胞昆虫细胞1外源基因表 达水平高比较高不高不高(家蚕除外)2培养条件易易难较难3表达产物的 形式多数不能分泌， 胞内形成包涵体多数能分泌， 少数在胞内形 成包涵体，有 时产物不均一一般都能分泌一般都能分泌4表达产物的 糖基化不能糖基化能糖基化，但 糖基化程度与 天然产物有差 别糖基化好，近 似天然产物能糖基化，但糖 基化程度与天然 产物有差别5产物纯化工 艺细胞破壁容易， 多数产物需“复 性”，工艺较复 杂胞内表达破壁 困难；分泌物 纯化工

11、艺简单纯化简单纯化较简单(家蚕 除外)6生产成本高，主要化费在 纯化方面低高，主要花费 在培养条件方 面高，主要花费在 培养条件方面(家 蚕除外) 7稳定性差较好好较好8难点复性破壁培养培养分离纯化技术要求：（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性 ；（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将 目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加 以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的 要求。一是破碎抽提，即把蛋白从材料转入溶剂中制成蛋白质 溶液； 二是纯化，即把杂质从蛋白质溶液中除掉或从蛋白质溶

12、 液中把蛋白质分离出来； 三是制剂，即将蛋白质制成各种剂型。根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列 问题: (1)要注意防止蛋白的变性失活. (2)蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂 质尽可能的除去，因此，在不破坏所需蛋白的条件下， 可使用各种“激烈”的手段。重组蛋白的分离提纯包括三个基本环节：蛋白的纯纯化过过程，约约可分 为为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质 打破细细胞 抽出全蛋白 .(2) 部分纯纯化 (partially purified): 初步的纯纯化，使用各钟钟 柱层析法。(3) 均质蛋白 (homogeneous): 目

13、标蛋 白的进一步精制纯纯化，可 用制备式电泳 或 HPLC。蛋白分离纯化不同阶段细胞结构与蛋白分布细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自 于肽聚糖的网状结构。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻 力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质 ，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。1 细胞破碎许多蛋白存在于细 胞内。为了提取这 些胞内蛋白，首先 需要对细胞进行破 碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-II D超声波细细胞粉碎机细细胞破碎珠高压

14、细压细 胞破碎机DY89-I型 电动电动 玻璃匀浆浆机机械破碎捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween酶促破碎自溶法 外加酶制剂法通过机械运动产生的 剪切力，使组织、细 胞破碎。通过各种物理因素的 作用，使组织、细胞 的外层结构破坏，而 使细胞破碎。通过各种化学试剂 对细胞膜的作用， 而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或 外加酶制剂的催化作用 ，使细胞外层结构受到 破坏，而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理细胞破碎机理图细胞破碎机理图常用常用细胞破碎技术和细胞破碎技术和设备设备机械

15、法：研磨，匀浆器，组织捣碎法，压榨器物理处理法：超声波化学法：酶解法： 机械法机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段 在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括珠磨法,高压匀浆法和超声破碎法WSK卧式高效全能珠磨机 高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方 法，它将细胞悬浮液 与玻璃小珠、石英砂 或氧化铝等研磨剂一 起快速搅拌，使细胞 获得破碎。 在工业规模的破碎中 常采用高速珠磨机砂磨机砂磨机高速珠磨机高速珠磨机 高压匀浆器 影响匀浆破碎的主要 因素是压力、温度和 通过匀浆器阀的次数 。 高压匀浆法的适用范 围较广，在微生物细 胞和植物细胞的大规 模处理中常

16、采用.高压匀浆器高压匀浆器高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法 高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 不宜使用高压匀浆法。 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）撞击破碎器撞击破碎器 超声波破碎器 超声波处理细胞悬浮液时， 破碎作用受许多因素的影响 ，通常声强和振幅影响很大 ，但强度太高易使蛋白质变 性，频率的变化影响不明显 ：此外介质的离子强度、pH 值、菌体的种类和浓度也有 很大的影响. 超声波振荡过程中遇到的最 大问题就是产生的热量不容 易驱散，所以影响了它在大 规模工业上的应用，但在实 验室和小规模生产中是一种 很好的方法JY92-II D超声波细细胞粉碎机