考研科目,动物生物化学核酸技术

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1、第17章 核酸技术 1. DNA重组技术2. 基因操作的主要技术3. 核酸技术的应用生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”（1）重要的工具酶 （2） 载体 （3）DNA重组的过程1 DNA重组技术（1）重要的工具酶它能够识别、切割双链DNA分子 中的特定序列，这些特定序列多数为 反向重复序列，一般长度是4、5或 6bp。 限制性内切酶 粘性末端：识别序列对称轴，左右两边 切开， 形成凸出部分。如 EcoR I: 5 -GAATTCCTTAAG-35 G G C C 3 3 C C G G 5Hae平头末端：识别序列中间切开同裂酶：产生相同的切割，形成相同的末端同尾酶：识别不同的序列，形成

2、相同的末端 DNA连接酶相邻DNA的5磷酸基团和3羟基形成磷酸二酯键。目前使用的连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶： 黏性末端连接 ；T4 连接酶： 黏性和平齐末端连接。 碱性磷酸酶催化DNA和RNA5磷酸基团水解， 产生5羟基末端，减少载体自身的环化 。（2）载体能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩 增或最终使外源基因得以表达的自主 DNA，称 为载体（vector）。分为： 克隆载体：用于基因的复制、扩增、测 序等； 穿梭载体：原核与真核细胞间遗传物质 的转移； 表达载体： 用于目的基因的表达。（3）DNA重组的过程 目的基因的获得 选择和制备载体 将目的基因与载体进行切割连接 将重组体

3、导入受体细胞 阳性克隆的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达等研究目的基因克隆的基本过程 目的基因的制备直接从染色体中分离人工合成逆转录合成cDNA构建基因文库PCR扩增 载体的选择和制备原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞 中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。 目的基因与载体的酶切与连接 重组DNA导入宿主细胞大肠杆菌、酵母、真菌及各 种真核细胞、受精卵细胞都 可用于重组。转化转染-（1）转化：将质粒或重组质粒导入宿 主细胞的过程。（2）转导：通过噬菌体或病毒的感柒 作用将外援基因导入细菌的过程。（3）转染：噬菌体、病毒为载

4、体构建 的重组体导入宿主细胞的过程。 目的基因的筛选和鉴定遗传标记法 核酸杂交法 PCR方法 免疫学鉴定 物理筛选遗传学方法（表型）利用载体的特殊标记,如质粒含有 抗 青霉素的基因，当含外源DNA的质粒 转 化后可在含有青霉素的培养基中生长 ， 而未转入质粒的细菌在同样的条件下 不 能生长。分子杂交技术Southern-blot 印迹杂交原理示意图 菌落原位杂 交 23626 聚合酶连锁反应（ PCR, DNApolymerase chain reaction ）DNA核苷酸序列分析 Sanger双脱氧链终止法 酶切鉴定目 的 基 因 表 达3 DNA技术的应用(1) DNA指纹技术(2)转基

5、因动物与动物克隆(3)基因诊断与基因治疗(1) DNA指纹技术( DNA fingerprint )DNA指纹技术是20 世纪70年代末发展 起来的遗传标记（genetic marker）的方法 。遗传标记是指可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。生物个体间的差异在本质上是 DNA 的 差异，因此DNA是最可靠的遗传标记。 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）真核生物的DNA分子很长，在遗 传 过程中DNA碱基由于替换、重排、插 入、 缺失等原因，在子代DNA中会引起差 异 形成多态性。用一种限制性内切

6、酶去切DNA时， DNA 分子会降解成许多长短不等的片段，个体 间 这些片段是特异的，可以作为某一DNA的 标 记，将这种方法称为限制性片段长度多态 性。在人体DNA文库中发现的由970bp重 复 单位串联重复排列而成的高变异区，称为小 卫 星DNA（minisatellite DNA）。 所有真核生物基因组中还存在由2-6bp 为 重复单位的重复顺序，因其重复单位比小卫 星 短，称为微卫星DNA（microsatellite DNA ）。 DNA指纹图谱（DNA fingerprint）。不同个体的多态性来源于重复单位的重 复次数不同。同一家族小卫星重复单位含有相同或相 似的核心序列，用某一

7、小卫星DNA作探针 ， 可与同一或不同物种多酶切DNA片段杂交 ， 获得高度个体特异性图谱称DNA指纹图谱 。人的DNA 指纹图谱DNA指纹图谱的特点： 一次能够检测十几个、甚至几十个 位 点的变异性，有效的反应组织的特异性。 具有很高的变异性。 DNA指纹图谱谱带从亲代遗传给子 代，儿女的指纹图谱中几乎每一条的图谱 中 找到。 DNA指纹图谱具有体细胞稳定性， 从 同一个体不同组织。 随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified polymorphic DNA，RAPD）是以910个核苷酸的随机序列作引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。产物电泳后紫外观察，不同个体的图带差

8、异明显，如DNA指纹图谱一样。(2)转基因动物与动物克隆 转基因动物 体细胞克隆无性繁殖1982 年，人们将大白鼠的生长激素基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白启动 子之后 。将重组好的这种质粒，用特制的微量 注射器注入小鼠受精卵的雄性原细胞核中 ， 再将这个受精卵植入小鼠子宫中。 转基因动物结果为发育成熟的小鼠体重比对照 小 鼠大两倍，成为“硕鼠”或“超级鼠”。1986 年，美国 制备出转生长激素基 因的猪。这种猪生长 快，饲料转换率和瘦 肉率显著提高而肥膘 低。我国现制备出 转基因猪、羊、兔等 。然而，转生长 激素基因的猪生殖能 力明显下降，不能繁 殖扩群。1996年7月世 界第一例从成年动物

9、体细胞， 克隆出的哺乳动 物绵羊“多利” 诞生。 体细胞克隆无性繁殖多利羊之父威尔穆特教授英国爱丁堡罗斯林研究所， 苏格兰胚胎学家。1998年克隆批 量化 美国克隆出50多只 老鼠。日本克隆出8 只完全一样的小牛 。美国俄勒冈州 沃尔小组成功 克隆两只恒河 猴。2000年人类的近亲被克隆克隆猪 同年，帮助培育出多利羊的 生 物技术公司克隆出5只小猪仔，并宣称克隆 猪 终将成为人类移植器官的“加工厂”，生 产器 官包括角膜、皮肤、肾、肝 、肺、心脏等 。珍稀濒危动物的繁殖 克隆大熊猫的 实 验已开始报道。2001年至今关于克隆人关于克隆人的问题争论的很激烈，在 理论上，利用同样方法，人可以克隆人

10、，但各 国至今还不允许克隆人。 2001年，美、意科学家联手展开克隆 人体胚胎的工作。11月，美国科学家宣布首次 克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，称其目 标是为病人“定制”出不会诱发排异反应的人 体细胞用于移植。2004年8月11日英国颁发全球首张“克 隆 人类胚胎”执照，合法执照有效期为一年 ，胚 胎14天后必须毁坏，培育克隆婴儿仍属非 法 行为。研究目的 增加人类对自身胚胎发 育 的理解； 增加人类对高危疾病的认识和 高 危疾病治疗方法的研究。克隆动物存在的问题克隆动物健康问题很 多，世界各地的克隆动物 流产、夭折、畸形现象非 常严重。尽管现在关于克 隆的争论很多，但有一点 是肯定的，那

11、就是克隆技 术远不成熟，应用克隆技 术时需格外慎重。多利虽顺利怀孕 生子，但寿命短，2003年 月 2 月 15 日，仅岁半 的多利羊死亡。 基因治疗在特定靶细胞的基因组中，插入 外 源基因或用外源基因置换异常基因， 使 细胞表达本来该基因不表达的产物， 籍 以补偿或抑制异常表达的基因，达到 治 疗疾病目的，称为基因（genetherapy ）。生物化学与司法鉴定1.死亡时间的推测发生7小时内肝中DNA的含量随死 时间的延伸而下降；脾中DNA的含量则上 升；肾、心肌和骨骼肌在7小时内不变。以 肝和脾中DNA含量变化的比值与死亡时间作 图，可得一直线，用此直线来推测死亡时间 其误差在16分钟之内

12、。2.暴力死亡中的生化：（1）经过搏斗后机械性死亡的心肌 中丁二酸脱氢酶和细胞色素氧化酶的活性 有及糖原的含量会明显升高，要经过20小 时之后才会明显下降。（2）机械性窒息(吊死和扼死）会引 起死亡者的血液中成纤维蛋白水解酶的含 量高于正常死亡的值，因此血液不凝固。（3）溺死者的肺中过氧化物酶活性 变化明显。3.性犯罪引起的死亡：鉴定时可在受害者身体及其衣 服等犯 罪现场中找到精子，或是污渍中有酸 性磷 酸酯酶活力，即使进行绝育手术的罪 犯也 能发现这种酶活力。 4 个人识别和亲子鉴定 （1） DNA“指纹图谱”用于个人识别 和亲子鉴定（2） 从个体的特征上来进行个人识 别 5 指纹：由于手指皮肤排泄物中除了含 有无机离子外，还含有维生素B2和B6化 合物和氨基酸、蛋白质类化合物。利用 激光照射在维生素B2和B6上产生荧光的 特性，用彩卷拍摄激光照相来摄取指纹 。6 血迹现场显示：用Luminol喷雾于现场，而后 在黑暗中去寻找发光的斑点，此斑点常 常是血迹，即使将现场进行一般性的打 扫，也不能排除用此法可找出血迹。