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1、第三章 核酸的分 离与分析 第一节 核酸的分离纯化v一、核酸分离提取的原则与要求 v二、核酸提取的主要步骤 v三、质粒DNA的分离纯化v四、基因组DNA的制备 v五、RNA的提取v六、核酸的定量一、核酸分离提取的原则要求v总的原则：保证核酸一级结构的完整性， 防止降解 ，排除其它分子的污染。如：防止核酸酶，特别是RNase的污染，又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子， 反之亦然。 二、核酸提取的主要步骤v1. 样品准备v2. 细胞破碎v3. 分离纯化核酸v4.核酸的沉淀浓缩v1. 样品准备新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。动物细胞：胰酶消化，离
2、心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀的细胞。液体培养的微生物：直接离心沉淀收集菌体。 v2. 细胞破碎物理方法、化学方法、酶法等。物理方法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法等。（注意：物理方法容易导致DNA链的断裂）化学方法和酶法：去污剂（SDS 0.5%1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K温和裂解。EDTA（5mmol/L)作用：与Mg2+结合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加入适量RNA酶。 v3. 分离纯化核酸关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。酚/氯仿抽提法：酚、氯仿: 两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。异戊醇: 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。细胞破
3、碎酚/氯仿水相（DNA 、小分子 RNA）界面（絮状 蛋白质沉淀 ） 有机相（色 素、脂类、 糖类）酚/氯仿提取除蛋白质原理示意图细胞悬浮液细胞抽提物v4.核酸的沉淀浓缩乙醇沉淀法：无水乙醇结合核酸分子所结合的水，使核酸沉淀。微量的DNA，可加入中等浓度的单价阳离子促进沉淀。如Na+，中和DNA分子上的负电荷，减少了DNA分子间的同性电荷相斥力。三、质粒DNA的分离纯化v重点考虑如何与基因组DNA相互分开。利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。v分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法等。v1.
4、 碱裂解法： 小量制备DNA较好的方法。基本原理：在碱性pH（12-12.5）下，DNA分子均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能 准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一起，能准确复性而留于上清溶液中。v2.煮沸法利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进行分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相中，通过高速离心（12,000 g）可实现分离。适于快速提取质粒 DNA并进行鉴定，也适用于大量提取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。v3. CsCl-EB密度梯度平衡离心CsCl是一种大分子量的重金属盐，长时间超速离心
5、时， 在管中形成11.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。染色 体DNA、质粒DNA、RNA以及蛋白质等，可在离心管内不同 位置形成区带。RNA可与Cs+结合，因此密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。四、基因组DNA的制备v基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上蛋白酶K温和裂解方法。v杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。五、RNA的提取v细胞中的rRNA、t
6、RNA和mRNA不容易完全分开，可先制得细胞核、线粒体、核糖体等细胞器和细胞质，然后再从中分 离某一类RNA。vmRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱柱分离。vRNA的提取要点：样品细胞或组织的有效破碎；核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；对RNA酶的有效抑制；将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。最关键的是抑制RNA酶的活性。 六、核酸的定量v核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重 要手段。v常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光 度法。紫外分光光度法v核酸的最大吸收
7、波长是260nm，吸收波谷在230nm。v根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50gmL；单链DNA或RNA为40gmL；单链寡核苷酸为20gmL。可以此来计算核酸样品的浓度，检测最低限为0.51.0gmL。v通过测定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若A样品的比值高于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留酚或蛋白质。 荧光分光光度法vDNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度
8、与核酸含量成正比。由此可建立标准曲线，测定未知样品的浓度。 第二节 核酸的凝胶电泳 v电泳：是利用带电荷物质的电场中的迁移速率的不同而将其分离的方法。v凝胶电泳：利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的大分子物质得以分离并在保留于凝胶中，在不同位置形成条带。v电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值（荷质比）相关。 v在中性pH或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 v在均一的凝胶网络中，核酸的迁移速率只与分子的大小相关，使不同分子量者分开，而相同分子量聚集形成条带。 一、琼脂糖凝胶电泳v琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：形成的凝胶具有大
9、量微孔，其孔径尺寸取决于它的浓度，如 0.75%琼脂糖的孔径为800 nm，1%琼脂糖孔径为150nm；透明，无紫外吸收；无毒，热熔冷凝，制胶方便；热可逆性，具有一定强度。 v琼脂糖凝胶的制备：将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围琼脂糖 浓度（ %）分离线状DNA 分子的范围（ kbp） 0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13凝胶电泳成像图谱二、聚丙烯酰胺凝胶电泳v聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（ acry
10、lamide，简称Acr）和交联剂（crosslinker）N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，简称Bis）交联成的三维网状结构的凝胶。v该凝胶孔径小、透明、弹性好、无紫 外吸收，可用于DNA、蛋白质等的分离。DNA在聚丙烯酰 胺凝 胶中的有效分离范围聚丙烯酰 胺浓度（% ）有效分离范围 （bp）3.51001000 5.080500 8.060400 12.040200 20.010100三、凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化v方法：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法等。vDEAE纤维素膜插片法简
11、便易行，回收率、纯度都很高，对回收500bp5kb左右大小的DNA片段效果很好。电泳洗脱法对大于5kb的DNA片段较适合。冻融法、SDS溶液浸出法等方法都极为简便，但纯度与回收率较差。v将低熔点琼脂糖挖块与玻璃奶法结合，可回收到质量较好的DNA片段。 第三节 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）v概念: 在引物存在的条件下、以DNA为模板、由DNA聚合酶催化的对特定基因或DNA序列进行体外快速扩增的反应，故又称为基因的体外扩增法。 美国Cetus公司科学家K.B.Mullis于1983年发明 一、PCR技术的基本原理及特点v双链DNA分子在临近沸点的温
12、度下便会分离成两条单链的DNA分子，当温度降低时，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的引物和四种脱氧核苷三磷酸（ dNTPs）合成新生的DNA互补链。 vPCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反应，便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106107倍的扩增。 v正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，意味着分子生物学分析只需要含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹等。这对于法医学鉴定具有特别的应用价值。同时，应当注意 ，任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生污染，确保实验结果的准确、可靠。二、PCR反应体系与条件优化v标准的PCR反应体系：v50l 1
13、00l体积，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA聚合酶（2.5U），2条引物（各0.25mol/L），KCl（50 mmol/L），TrisHCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5 mmol/L），明胶或牛血清白蛋白（BSA）（1g/ml）。v1. PCR反应模板v（1）种类：可来自任何生物的单链或双链DNA，也可以是用化学方法合成的。v（2）数量：一般而言，PCR检测可以用纳克（ng）级的DNA克隆模板或微克（g）级的基因组DNA，或者是拷贝数为105的目的DNA片段。v（3）纯度：对样本纯度的最基本要求：一是要含有至少一个包含有待扩增片段的完整的分子，二是
14、其他的不纯物的浓度不会抑制酶的活性。v传统的DNA纯化方法完全可以满足PCR反应要求。v2. PCR反应的缓冲液vPCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素。vMg2浓度非常重要，它是PCR反应中DNA聚合酶的辅助因子。反应体系中许多成分都结合Mg2，包括引物、模板、PCR产物和dNTP。通常，Mg2的总浓度必须超过dNTP的总浓度。在一般的PCR反应中，1.52.0 mmol/L Mg2是比较合适的（对应dNTP浓度为200 mol/L左右）。 v3. 底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度vPCR反应中，dNTP浓度应在20200mol/L，高浓度dNTP可加快反应速度，但同时会增加碱基的
15、错误掺入率和实验成 本；低浓度dNTP虽会导致反应速度下降，但可提高实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注意二者浓度之间的关系。v4. PCR反应的DNA聚合酶v100l反应体系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量为0.55U。根据扩增片段的长短及其复杂程度（GC含量）不同而有所区别。v使用Taq DNA聚合酶浓度过高，会引起非特异产物的扩增；浓度过低则合成产物量减少。v5. PCR反应的引物v（1）引物设计原则vPCR引物通常长1525碱基，其中GC约占50%。v引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成
16、发夹结构。v引物的3末端必须与目的片段完全相配。v引物的5末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。v（2）引物Tmv加热可以打开双链结构，当一半分子为单链而另外一半分子 仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA的熔解温度，即Tm。由于GC碱基对间的氢键数较AT碱基对间的多，故GC含量高的DNA的Tm值也较高。vPCR反应中引物浓度一般为0.10.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，同时会增加引物之间形二聚体的几率。 v6. PCR反应条件的选择v94，30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。v复性温度的选择，可以根据引物的长度及其GC含量确定。长度在1525bp之间时，退火温度可通过Tm=4（GC）2（AT）计算得到。退火时间设置为30秒钟。vPCR反应的延伸温度建议选择的72，此时，Taq DNA聚合酶具有最高活性。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长
