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1、第五章 食品中微生物标准检 验与分析技术第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析一、菌落总数介绍食品验样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分 、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g)验样中形成菌落的总数。国家标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析 食品污染程度的标志 预测食品存放的期限卫生学意义二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍 递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养
2、琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间 后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依 据稀释倍数，计算出每克（或每mL）原始样品中所含细菌菌落总数。 基本操作一般包括：样品的稀释-倾注平皿-培养48小时-计数报告。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析三、检验程序GB/T4789.2-2003第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析四、操作步骤 （一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量1、500mL广口瓶 1个 2、500mL三角瓶1个 3、250mL三角瓶 2个 4、18180mm试管3支 5、1mL移液
3、管5 支6、直径为90mm平皿 10套7、250mL量筒1支8、玻璃珠：直径约5mm9、剪刀1把 不锈钢药匙1把 第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析样品：袋装鲜奶1操作方法用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称 取检样25mL，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用 225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入，振摇均匀，即为1:10的 稀释液。 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含 有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均 匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液 ，如此
4、每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释1操作方法根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释 度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管 移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转 动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀 释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h 。第五章 食
5、品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析（二）样品的处理和稀释（四）菌落计数1、计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准 要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于 2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀 释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU ）表示。2、若所有稀释度均不在计数区间，如均大于300，则取 最高稀释度的平均菌落数乘
6、以稀释倍数报告之；如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落 数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则 应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如 所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。（四）菌落计数第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析3、不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比， 即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如 出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数 报告的依据。4、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存
7、在有几条不 同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生 长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般 不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀 ，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。（四）菌落计数第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析（四）菌落计数第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析5、当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大 于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数五、菌落数报告按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字 报告，如大于1
8、00时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。 报告方式以下表为例（四）菌落计数第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第一节 总菌落数的检验与分析第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析大肠菌群是指一群在37培养24小时能分解 乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无 芽孢杆菌。作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析第二节 大肠菌群的检验与分析检 测 步 骤1、检样稀释MPN：表示食品中大肠菌群数是以每100mL或克检 样内大
9、肠菌群最近似值，一般采用9管法。一般样品25mL（克）+225mL生理盐水=1：10，从此 10-1取样10mL，则其中含样品为1mL（克）。接种到3管 双料乳糖发酵管中。从此10-1取样1mL，则其中含样品为 0.1mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。表142 143。从10-1取样1mL+9mL生理盐水=1：100，从10-2取样 1mL，则其中含样品为0.01mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析2、乳糖发酵试验（1）培养基单料乳糖胆盐发酵管：蛋白胨 2 % 猪胆盐（或牛胆盐 ）0. 5 % 乳糖 1 % 、1 .
10、6 % 溴甲酚紫酒精液 0 . 06ml pH 7.4。制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入 指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115高压灭 菌15min。 双料乳糖胆盐发酵管 除蒸馏水外其他成分加倍。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析（2）原理溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄 色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群。胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。分解乳糖产酸产气的大肠菌群，看小倒管中的气体。第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析杜氏发酵管产
11、气情况1 产气 2 不产气第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析鉴别培养基 名称加入化学物质微生物代 谢产物培养基特征性 变化主要用途H2S试验培 养基糖发酵培养 基伊红美蓝培 养基醋酸铅溴甲酚紫伊红、美蓝H2S乳酸、醋 酸、丙酸 等酸产生黑色沉 淀由紫色变成 黄色带金属光泽 深紫色菌落鉴别产H2S菌 株鉴别肠道细 菌鉴别大肠菌 群3、鉴别和分离培养第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析4、证实试验（1）革兰氏染色：阴性、短杆菌（2）乳糖复发酵：产酸产气第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析粪大肠菌群的检验检验
12、的稀释 乳糖发酵试验 证实证验（ EC肉汤发酵 伊红美蓝培养基） 结果评定第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤, E.Coli Broth ）第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析第一个半天 器材准备准备器材并灭菌，如下： 1、250mL三角瓶 1个2、18180mm试管 2支 3、乳糖发酵管（带黑帽或棉塞，有刻度试管，内带 小倒管） 15支4、250mL量筒 1支5、1mL移液管 2支6、10mL移液管 2支7、平 皿 6套第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析第二个半天 样品处理
13、及初发酵1、样品处理2、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验3、培养1826小时，于3537摄氏度第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析第二天 伊红美蓝培养基分离培养接种EC肉汤（粪大肠菌群） 1、伊红美蓝培养基分离培养2、接种EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤, E.Coli Broth ）第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析伊红Y是一种酸性染料,有色部分为阴离子(E-) 美蓝是一种碱性染料,有色部分是阳离子(M+) 。细菌细胞的主要成分是蛋白质,由于蛋白质系两 性电解质,在偏酸性环境中正电荷增多,易与伊红结 合,在碱性环境中负电荷增多,易与美蓝结合。
14、而细 菌发酵乳糖是产酸的. 美蓝并不是完全不起作用， 多见于典型的大肠杆菌 (乳糖发酵很迅速),在伊红 染成粉红色之后,美蓝可以继续将其染成紫黑色带 金属光泽的菌落。第三天 证实试验1、乳糖复发酵试验2、从阳性EC肉汤接种EMB分离培养。3、EMB典型菌落革兰氏染色镜检第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析革兰氏染色：阴性、短杆菌第四天 观察结果与器材消毒与清洗1、观察乳糖发酵管结果2、观察EMB培养结果并革兰氏染色镜检3、器材消毒与清洗4、查表报告结果与撰写实验报告第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 大肠菌群的检验与分析第五章 食品中微生物标准检验与分析
15、技术第二节 沙门氏杆菌的检验与分析沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动 物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆 菌统称为沙门杆菌。一、沙门氏菌生物学特性第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 沙门氏杆菌的检验与分析1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定 名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对 人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜 以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪 便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起 的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。 1、沙门氏杆菌简介第五章 食品中微生物标准检验与分析技术第二节 沙门氏杆菌的检验与分析沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。导致胃肠炎、伤 寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括 哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。已发现的近一千种（或菌株）。按其抗原成分，沙门氏菌可 分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙
