酵母RNA的分离与组分鉴定 实验目的 § 掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作 过程 § 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体 方法实验原理 § 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异 ，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法其中苯酚法又 是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理并离心后， RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则 留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状 沉淀析出此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的 RNA具有生物活性 § 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体 的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为 0.03%~0.516%为此提取RNA多以酵母为原料工业 上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或 浓盐法这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主 要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单 § 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解 ，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清 液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀 提取的RNA有不同程度的降解浓盐法是用高 浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的 通透性，使核酸从细胞内释放出来。
§ RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分 加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖 ，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等 方法测出上述组份的存在1）嘌呤碱与硝酸 银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀2）地 衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发 生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与 地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该 反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂3）磷 酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 [(NH4)3PO4·12MoO3↓] 仪器、原料和试剂 §仪器：试管；试管架；100mL氢氧化钠烧杯；移液管0.2mL（×1） 、2.0mL（×2）、1mL（×2）； 量筒10 mL、50mL各一个；滴管 ；水浴锅；离心机；布氏漏斗 §原料：干酵母粉 §试剂：（1）0.2%氢氧化钠溶液；（2）95%乙醇；（3）乙酸、乙醚；（4）10%硫酸；（5）0.1mol/L硝酸银溶液；（6）1mol/L浓氨水；（7）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；（8）三氯化铁-浓盐酸溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O ）溶 液加入400mL浓HCl中；（9）地衣酚-乙醇溶液：称取6g地衣酚溶于100mL 95％乙醇；（10） 钼酸铵试剂：将2g钼酸铵溶解在100mL10%硫酸中。
实验步骤 § 1、酵母RNA的提取称4g干酵母粉悬浮于40mL 0.2%NaOH 溶 液中并在研钵中研磨均匀悬浮液转入100mL 烧杯中 沸水浴加热30分钟，不断搅拌冷却， 3000r/min离心10-15分钟后，将上清液慢慢倾 入10mL酸性乙醇，边加边搅加毕，静置，待 RNA完全沉淀，3000r/min离心3min弃去上清 ，用95%乙醇洗涤沉淀两次（每次10ml），继 而用无水乙醚洗两次（每次10ml），洗涤时可 用细玻璃棒小心搅动沉淀用乙醚将沉淀转移 至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥称量所 得RNA粗品的重量 § 2．RNA组分鉴定水解RNA：取0.5~1g提取的核酸，加入10% 硫酸10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后 进行组份鉴定1）嘌呤碱：取一支试管，加入1mL水解液 ， 加入过量浓氨水（约2mL）然后加入1mL 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉 淀2）核糖：取一支试管，加入水解液1mL， 三氯化铁浓盐酸溶液2mL和地衣酚乙醇溶液 0.2mL放沸水浴中10min注意观察核糖是否 变成绿色3）磷酸：取一支试管，加入2mL水解液， 然后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后，在沸 水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。
计算 RNA提取率（%）=RNA质量（g）/干酵 母粉质量（g）×100%注意事项§ 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于 RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作 为RNA生物活性实验材料 § 利用等电点控制RNA析出时，应严格控 制pH § 地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反 应因此地衣酚实验不能作为RNA与 DNA鉴别的依据思考题 § 所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化 ？ § 若用氯仿-异戊醇进一步处理RNA制品， 可获得纯度更高的RNA § 现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白 质、糖和RNA，采用什么试剂和方法鉴 定？（自行设计简便的实验） 。