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1、第四章第四章 体内药物分析体内药物分析方法的建立与验证方法的建立与验证*1体内药物分析F分析方法的设计依据F分析方法建立的一般步骤F分析方法验证的内容与要求F体内药物分析应用示例本章内容提要第四章 分析方法的建立与验证Date2体内药物分析第一节 分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 分析测定的目的与要求 生物样品的类型与预处理方法 实验室条件第四章 分析方法的建立与验证Date3体内药物分析一、待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物预处理待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法首先应考虑待测药物的理化性质
2、药物在生物体内的存在状况药物在生物体内的生物转化(代谢)途径第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date4体内药物分析(一)待测药物的理化性质药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等具有挥发性GC测定法具有光谱或电化学特性分析检测方法药物的稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂对热不稳定避免高温蒸发溶剂第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date5体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低分
3、离萃取方法蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术浓度较低（尤其有代谢产物共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用LC-MS、EIA等分析检测技术 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date6体内药物分析二、分析测定的目的与要求体内药物分析的目的影响分析方法的应用药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求 同时测定原形药物和代谢产物检测 宽线性范围(CmaxCmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)方法 不必强调
4、方法的简便、快速；大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date7体内药物分析二、分析测定的目的与要求临床治疗药物监测有效治疗浓度范围内药物浓度方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定大多采用UV、RIA或EIA等中毒患者的临床抢救药物浓度极高方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date8体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用以血浆或血清为
5、分析样品采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术分析样品较为“干净”，可用HPLC检测用RIA分析样品的预处理方法可较为粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date9体内药物分析四、实验室条件在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据Date10体内药物分析第二节 分析方法 建立的一般步骤 一、分析方法的选择一、分析方法的选择二、分析方法的建立二、分析方法的建立( (一一) ) 检测条件的筛选检测条件的筛选( (
6、二二) ) 分离条件的筛选分离条件的筛选第四章 分析方法的建立与验证Date11体内药物分析一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少难以通过增加取样量提高方法灵敏度通过选择适当的分析方法适应样品分析需求体内药物分析中常用分析方法特点见表4-1第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date12体内药物分析二、分析方法的建立 分析方法建立之前查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法
7、的建立步骤Date13体内药物分析二、分析方法的建立 初步拟定分析方法后进行一系列试验工作选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品F 分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的为便于讨论而分别叙述F 分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第二步：分离条件的筛选第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date14体内药物分析(一)检测条件的筛选标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC 调整检测器(类型、条件) 色谱柱(型号、牌号、填料性状与
8、粒经、柱长度)流动相(组分及其配比)及其流速柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)良好的色谱参数(n、R、T)适当的保留时间(tR)第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date15体内药物分析(二)分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)2空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性)3模拟生物样品试验 方法效能指标4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性)第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步
9、骤Date16体内药物分析1空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）考察目标方法的特异性空白值应尽可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date17体内药物分析色谱分析法可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R1.5） 本步骤主要考察需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离
10、，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date18体内药物分析2. 空白生物基质试验空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血浆照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date19体内药物分析3. 模拟生物样品试验模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物照 “1. 空白溶剂
11、试验” 项下方法操作考察目标方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度药物的萃取回收率等各项技术指标同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date20体内药物分析色谱分析法进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致色谱峰是否为单一成分标准曲线的截距是否显著偏离零点等内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date21体内药物分析4. 实际生物样品的测试空白生物基质和
12、模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)实际生物样品确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试考察目标代谢产物对药物、内标物质的干扰情况进一步验证方法的可行性第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤Date22体内药物分析第三节 分析方法 验证的内容与要求用于实际生物样品分析之前验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性方法验证时应考虑影响分析方法所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等)使用的技术指标效能指标
13、使用的样品通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品第四章 分析方法的建立与验证Date23体内药物分析验证步骤首先为分析方法的验证特异性、精密度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求Date24体内药物分析验证的效能指标与基本要求1特异性避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要
14、求Date25体内药物分析一、方法特异性(专属性或选择性)方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求Date26体内药物分析1. 内源性物质的干扰比较待测药物或其活性代谢产物检测信号对照品（或标准品）空白生物
15、基质模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致及与内源性物质色谱峰的 R确证内源性物质对分析方法有无干扰第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求Date27体内药物分析2. 代谢产物的干扰比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增加)的 R如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 或改变色谱条件(色谱柱)再比较确证其它代谢产物对分析方法有无干扰结构已知的特定活性代谢物的测定必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求Date28体内药物分析3. 伍用药物的干扰TDM 时还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第四章 分析方法的
