《牛胚胎移植技术的开发与应用研究阶段总结报告》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牛胚胎移植技术的开发与应用研究阶段总结报告（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 4 黑 龙 江 畜牧 科技 l 9 9 9年第 4期 目平 均产 奶量 分 剐 为 2 2 3 5 k g和 2 2 4 1 k g 乳 脂 率 分 别 为 3 8 6 和 3 9 2 ， 日产 标 准 乳 分 别 为 2L 8 8 k g和 2 2 1 4 k g 。 2 2节省 饲料 开 支 试 验组 以生 物料 代 替 部 分混 合 料 ， 试验 中对 照 组每 天给精 料 9 5 k g 试 验 组 以 7 k g生 物料 代 替 混 台辅 料 3 j k g ， 混 台 料每 千克 1 3 0元 t 生 物 料 每千 克 0 3元 ， 试验 组 中每 头 牛每 天 节 省饲 料
2、费 2 4 5元 ( 扣 出少 产 标 准 乳 0 2 6 k g1 6元 3 6 5 d 一 1 5 1 8 4元 ) ， 所 以 ， 用 生 物 料 代 替 混 合 精 料 ， 每 头牛 每年 可节 省 饲料 费 7 4 2 4 1元 。 牛胚 胎移植 技术 的开发 与应用研 究 阶段 总结报告 一棚 f 婶 小 藕 畜 摘要 9 9 5 l 9 9 7年共 计超排 供 体 牛 1 4 6头次 ， 有 效 1 4 0头 次 有 效率 9 5 8 9 ， 采 卵 O共 姨， 荻 卵 1 2 2 8 杜 ， 头均莸 卵 8 7 7 牧 其 中可 用胚 8 2 7牧 ， 头均 可用 胚 5 9
3、l枚 。共 计 移植 奶 牛夸 毒胚 胎 2 3 头 次， 受胎 1 0 2岳 受胎 卓速 4 4 2 移植 性 鉴别 胚 5 g头次 ， 产 犊 2 1头 ( ， 早1 0 ) 性 鉴 别 符舍 率连 1 0 0 。 美t 饲奶 牛 I 胚 胎 移植 ， 开发 I 应 用I 性 鉴别 1方 法 供 体 ： 黑 龙 江 省 膏牧 研 究 所实 验 牧 场饲 养 的 体 质 健康 、 性 周期 正 常无 生 殖 疾 患 的 1 6月 龄 5 罗 的优 质高 产荷斯 坦母 牛群 。 受 体 ： 在 富裕 县 友 谊 乡 、 齐 市 新 中畜 牧 场、 克 东 县 双 庆乡 选 择 体质 健 康 、
4、 性 周 期 正 常 、 无 生 殖 疾病 的黑 白花 低 产妍牛 或本 地牛 为受体 1 1 超 数排 卵 与 采 集 胚 胎 应用纯 化 F S H 制 剂 ( 中科 院动 物 所 、 中 国农 科 院畜牧 所 产 ) t 在供 体 牛性周 期 9 1 2 d进 行 如 下超 排处 理 ： 连续 4 d递减 常 规超 排 I 连续 4 d递 减常规 超排 ， 发情 输精 时加 量注 射促排 3号 I 连 续 3 d递 减超 排 。 于供 体牛 发情输 精 后第 7 d采集 胚胎 。 1 2 胚 胎 冷 冻 、 解 冻和 移 植 采 用形 态学 评定 方法评 定胚 胎 品质 选 择 A、 B
5、级胚 胎 应用 0 5MG( 甘 抽 ) 、 L 0MG、 1 4MG， 分 三步 每步 1 0 r a i n ， 添加 冷 冻保 护 剂 分三 段 装 入 0 2 5 r a t 塑料细管， 中问鼢冷冻保 护荆和胚胎 收 藕 日期 t 1 9 9 9 1 O 一1 3 两端 为 0 5 M 蔗 糖 一P B S 。将 细 管置 于 l 0 玲冻 仪 内 ， 2 “ C rai n降 至 一7 平衡 5m- n后 植球 平衡 1 0 rai n 以 O 3 mi a降至 一3 2 平衡 1 0 mi v 后 浸 入液 氨 中保 存 。 解 冻 时将 细 管从液 氮 中取 出 于室 温空 气
6、中停 留 5 1 0 s 后 ， 放 入 3 2 水 浴 中摇 动解 j糸， 然 后将 细 管 内溶 液滴 于皿 内 ， 1 O rai n后将 胚胎 取 出 ， 并 吸 取少 量溶 液 ， 移 入与 其 等量 的 2 0 F C S P B S液 ， 1 0 r a i n后 以 2 0 F C S P B S洗 三 遍 分 三 段 装 0 2 5 ml 塑料 细 管 ， 移植 给发 情 后第 7 d受体 牛黄 体侧 子 宫角 ： 在 移植 后的第 6 O 9 0 d进 行妊 娠谚 断 。 1 3 胚 胎 性 别 聚 合 酶 链 式 反 应 技 术 ( PC R) 鉴 定 1 3 1 牛 雄
7、性 特异 引 物 的合成 按参 考 文献 1 进行 。 1 3 2胚 胎 样 本 准备 显徽 切 割 刀 的制 作 ： 将 剃颓 刀 片用 脏 固定 于 细 玻璃 臂上 制 戚 。用 7 5 酒 精 消毒 ， 再 用 灭 菌蒸 馏 水 冲洗 三次 备用 。 明 最l 固 卜， 荣 铁OD 昊 ) ， 权 胜 是 牛胚 胎移植 技 术 的开发 与应 用研 究阶段 总结报 告柏学进 等 l 5 将 洗净 的 胚胎 放 在 5 p VP+P B S( 一 ) 液滴 中 ， 上覆 盖矿 物 油 ， 进 行胚 胎 切 割 ( 注 意 切 割 刀安 装 角度 ) ， 切 取少 量 ( 滋养 层 ) 细 胞
8、 。将 被取 样 的胚 胎 细胞 进行 培养 后移 植 或冷冻 保存 。 将 切 取 的 少 量 细 胞 用 P B s液 洗二 次 之 后 ， 用微 细 管 吸 出( 古 2 P B S液 ) ， 滴 入微 揖 0 5I 离 心 管底郊 ， 加 8m 去高 子术 ， 加 5m 矿 物 油， 煮 拂 3 mi n后 高速 离 心， 取 上 清 液直 接 扩 增 或 放 入 一2 0 冰箱 保存 至 扩增 。 1 3 3溶 液 的 配 制 拄参 考文献 ( 2 进 行 1 3 4 扩 增 前 准备 P C R J Ki t 购 自北方 同正 生物 技术 发展 公 司 每 个样 品离 心管加 ：
9、用 去离 子水 2 0 0 稀 释 的弓 物( 1 0 OD) ， 各 取2 ( 约5 Ol O 。 * mo l 1 ) I 加入 l U g l 的 Ta c t 酶 2mI 加 d NT P2 加入 1 0 P C R缓 冲液 2 5 g h 加 Mg C 1 2 mI加样 品 8 O I加 去 离 子 水 5 5 I 至 2 5m I加 矿 物 油 251 。 以上 操作 在 冰 盘 中进 行 ， 高 速 瞬 闻离 心 后放 P CR扩增 仪扩增 。 1 _ 3 5 PCR 扩 增 9 5 “( 2， 5 0。 5 O ， 6 0 I 船 ， 4 O日 。5 0十 周期 最后 一个 周
10、 期 在 7 2 “( 2 放置 5分 钟 。 l _ 3 6电 泳 观 察 每个 样本 取 3 染 色液 ， 滴 于 封 口膜 上 ， 加入 5 mD W ， 加入 8 u l 样 品 ， 混 均后 取 1 0 l 5 J l ， 加入 电泳槽 中琼 脂凝 胶 的梳孔 内进 行 电泳 。 通 以 8 v c m 左 右 的 电压 ， 电泳 2 0 鲫 rai n ， 使 样本 DNA 向阳极 移动 。 染 色 与 观 察 带 型 ： 将 凝 胶 铺 于 塑料 薄 膜 上 浸 入 含 0 5 g ml 的 EB( 嗅化 乙锭 ) 使 用 液 中染 色 2 0 rai n ， 注意 EB有 致癌
11、 作 用 ， 戴乳 胶手 套操 作 。 将 染 色后 的凝 胶 置 于 紫 外观 测 暗 箱 内 ， 在 观察 孔 上 盖 一有 机玻 璃 板 ( 防 止 紫 外 灯 对 眼睛 的 损 伤 ) 开 启 反射 紫 外灯 ， 调整 高度 及 角度 观察 ， 具有 亮带 的 为雄 性 ， 1 4性 鉴 别 胚 的 冷 冻与 解 冻 按参 考文 献 3 报 道 的 奶 牛 半 胚 裸 露冷 冻 保 存方 法进 行性 鉴别 胚 的冷 冻保 存 和解 冻及移 植 2结 果 2 1 超 排 与 采 卵 1 9 9 5 l 9 9 7 年 共计 超 排H6头敬， 有 效 1 4 0头 次 ， 采卵 1 4 0
12、 头 次 ， 获胚 1 2 2 8 枚 ， 头均 8 7 7枚 ， 获 可用胚 8 2 7枚 ， 头均 5 9 1枚 ( 见袁 1 ) 袁 l 各年 度 超排栗 卵蛄莱 如 表 2所示 ， 3 d递 减 超 排 效 果 极 显著 低 于 l d 递 减 常规 超 排效 果 ( P 0 05 ) 2 2移 植 1 9 9 5年 1 9 9 7年 共 计 移 植 2 3 1头次 ， 受 胎 1 0 2 头 受胎 率达 4 4 2 ， 移 植 受胎 逐 年显 著提 高 ( 见表 4 ) 。 2 3性 墼 剐胚 的移 植 噩 产 槟 符 合 率 袁 4各 年度移 植 受胎情 巩 注 a 、 h问 -
13、b 、 c问差 异显著 t 而 a h问差异槛 显著 袁 5各 年度性 鉴剐 胚的移 植 、 受胎 &产犊 符合 情 巩 如 表 5所示 ， 共 计 移植 性 别 鉴 定 胚 胎 5 9头 次 ， 受 胎 2 2头 ， 产 下 2 l头 犊 牛 ， 1 0头 母 犊 儿 头 公犊 ， 鉴别 符 合率 达 1 0 0 3讨 论 车 试 验 初 步 探 讨 了 牛 胚 胎 移 植 技 术 产业 化的 可行性 ， 三年 问共 计 采 卵 1 4 0头 孜 ， 获可 用胚 8 2 7枚 ， 头 均 可用 胚 5 9 1 枚 移植 受体 牛 2 3 1头 欢 ， 受 胎 1 0 2头敬 ， 受 胎率 达
14、 4 4 2 。试 验结 果表 明 ， 每 天按 时 观 寨 供 体牛 发 情 情 况 ， 做 好 详 细 记 录 选挥 营养 状 况 良好 - 发情 后 9 1 2 d具 有 明 显 黄体 的供体 牛 - 严格 按照 操作 规程 进行 超 排处 理 根据 十体 不 同 ， 调整 超排 物剂 量 淘 汰超 排效 果差 的供 体 牛 ， 因而 获得 了稳 定 的较 抒 超 排效 果 。另 外 ， 由于移植 人员 的技术 水 平不 断提 高 并 且在 移 植 时 选 择 营养 状 况 良好 发 情 时症 状 明 显 ， 子 宫 状 况 正 常 - 发 情 后第 7 d具 有 明显 黄体 的 受 体
15、 牛 进 行 移 植 ， 并 且在 胚胎 解 冻 过程 中 ， 严 格 操 作 ， 固 而使 移植 受舶 率显 著提 高至 4 6 3 。另外本 研究 为泰 廉县 、 双城市 、 及八五 一一 农 场提供 了优 质美 国大 型 荷 斯 坦奶 牛 胚 胎 4 0 7枚 ， 并 取 得 了较 高 的 移 植 受胎 率 ， 初 步形 成 了牛胚 胎 移植 技 术 的开 发 与 应用模 式 。 率试 验对 超排 方法 进行 了初 步简 化 ， 获 得 了头 均 4 9枚 可用 胚 的 良好 结 果 ， 虽 减 少 了 工 作量 ， 节省 了药 品 ， 但极 显著 低 于 4 d常规超 排 效果 ( P 0 0 5 ) =车 试验 移 植 P C R 技 术 鉴定 性 别 的 冷 冻 胚 胎 5 9枚 ( 受 胎率 3 7 3 ) 性 鉴 别符 合率 达 1 0 0 - 将 P C R 性 鉴别 技术 与半 旺冷 冻 保存 技术 结合 ，
