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1、基于基于 COI 序列的哈蟆油基原动物序列的哈蟆油基原动物 DNA 条形码鉴定研条形码鉴定研究究摘要 哈蟆油具有较高的经济和社会价值，其混伪品较多，给市场造成了很大 的混乱。利用基于 COI 序列的 DNA 条形码技术对已鉴定的东北林蛙、中国林蛙、桓仁林 蛙和黑龙江林蛙进行 PCR 扩增和测序，建立 4 种林蛙 COI 基因数据库；将所测的序列与 GenBank 上的序列进行比对，显示为上述 4 种林蛙；应用 MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）7.0 软件计算 K2P 遗传距离并构建 NJ（neighbor-joining）系统聚类树，
2、 所测 4 种林蛙的序列和 GenBank 上下载的 4 种林蛙的序列分别聚为 1 支，但与 GenBank 上下载的 2 个外群独立分开，东北林蛙的 COI 基因可能存在地域性差异，但该技术并不能 鉴别林蛙的雌雄。结果显示 DNA 条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物，说明 DNA 条形码 COI 为哈蟆油基原动物的鉴定提供一个新的手段和方法。 关键词 哈蟆油；东北林蛙；中国林蛙；DNA 条形码；鉴定 Identification of Ranae Oviductus original animal based on COI sequences WANG Meng-hu，KANG Ting
3、-guo*，XU Liang*，YANG Yan-yun，CAI Zhen-jiao （Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China） Abstract Ranae Oviductus has a high economic and social value， but its adulterants are more numerous， which causes a great confusion to the market. Using DNA bar code technology based
4、 on COI sequence for PCR amplification and sequencing of the identified Rana dybowskii， R. chensinensis， R. huanrensis and R. amurensiss， the COI gene database of four species of Rana was established， and comparing the measured sequence with the sequence of GenBank， four kinds of Rana were identifie
5、d. The MEGA （molecular evolutionary genetics analysis） 7 .0 software was used to calculate the genetic distance of K2P and construct the NJ （neighbor- joining） system cluster tree. The sequence of the four species of Rana measured were clustered into one group with the sequence of the four kinds of
6、Rana downloaded from GenBank， but separated from the two outer groups downloaded from GenBank. The COI gene of the R. dybowskii was likely to have regional differences， however this technique failed to distinguish male and female Rana. The results showed that DNA bar code technology could accurately
7、 identify the base of original animal of R. oviductus. It indicates that DNA bar code COI provides a new method for the identification of R. oviductus. Keywords Ranae Oviductus； Rana dybowskii； Rana chensinensis； DNA barcode； identify 哈蟆油作槊贵动物药及滋补品，其性平，味甘、咸，归肺、肾经，具有补肾益精，养阴润肺的功效1。哈蟆油作为辽药六宝之一和辽宁特色的满药品
8、种，其基原动物主 要分布在长白山地区。过去在中国分布的林蛙命名比较混乱，各地区的林蛙命名经过几次 变动。自 1985 年版中国药典至今记载哈蟆油的基原动物为中国林蛙 Rana temporaria chensinensis1，近年来部分学者认为哈蟆油的基原动物为东北林蛙 R. dybowkii2-7，我课 题组对哈蟆油的基原动物进行考证，认为哈蟆油的基原动物为东北林蛙。 四库全书盛京通志记载“山蛤多伏岩中，似rW 而大，腹黄红色，俗称哈什蟆”；辽海丛书沈故篇记载“哈什马形似田鸡，腹有油如粉条，有子如鲜蟹黄，取以作羹，味极肥美，然唯与京一带有之。满洲人用以祭祖，取其也 。 ”8根据上述记载， “
9、盛京”、 “兴京”分别指今天的辽宁省沈阳市、辽宁省新宾满族自 治县，说明哈蟆油的基原动物分布在辽宁地区，现在辽宁新宾依然是哈蟆油的主产区之一。 本实验收集长白山地区的东北林蛙、桓仁林蛙和黑龙江林蛙与内蒙古地区的中国林蛙，并 鉴定为上述 4 种林蛙。提取 4 种林蛙的总 DNA，进行 PCR 扩增并测序，将所测序列与 GenBank 上的序列进行比对。本实验首次利用 DNA 条形码技术鉴定 4 种林蛙和对不同地 域的东北林蛙进行鉴别，结果显示 DNA 条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物；东 北林蛙线粒体 COI 基因的 2 个位点呈现地域性的变异，该变异位点是否具有稳定性需要进 一步研究。
10、1 材料 EPS-600 型电泳仪，MG96G 型聚合酶链反应（PCR）仪（杭州朗基科学仪器有限公 司） ，Tanon-4100 型凝胶图像处理系统（美国 Applied Biosystems 公司） ，Fresco17/21 型台 式冷冻离心机（上海巴玖实业有限公司） 。 Ezup 柱式动物基因组 DNA 抽提试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司，引 物（北京天根生化科技有限公司） ，Trans 2K DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司） ， 2Taq MasterMix（北京康为试剂生物科技有限公司） ，琼脂糖和溴化乙锭（EB）均购自上 海 Sangon 公司，其余均为分析
11、纯。 实验样品及下载于 GenBank 的序列见表 1，中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙 江林蛙均经大连历史博物馆两栖动物研究员孙峰鉴定。 2 方法 2.1 DNA 提取 用灭菌后的手术剪把样品（肌肉）剪碎，加液氮研磨，取约 20 mg 样品，使用 Ezup 柱式动物基因组 DNA 抽提试剂盒（生工）提取总 DNA，具体操作步骤按照试剂盒操作说 明进行。 2.2 PCR 扩增和电泳条件 引物为动物 COI 基因通用引物9-11，包括正、反 2 个方向，正向引物：LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，反向引物：HCO2198 5- TAAACTTTCAGG
12、GTGACCAAAAAA-TCA-3。PCR 反应体积为 50 L，体系内含 Taq Master Mix 25 L，引物对各 2.0 L（10 mol L-1） ，DNA 提取液 4 L，加去 RNA 酶水 补足至 50 L。扩增程序为：95 ，3 min；94 ，40 s，3542 ，1 min，72 ，1 min，35 个循环；72 ，10 min。取 5 L 的 PCR 产物，用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳， 条件为 100 V，230 mA，35 min。Marker 采用宝生物（大连）DL 2000 Marker，Marker 相 对分子质量标准从上至下为 2 000，1 000
13、，750，500，250，100 bp。 2.3 序列测序及数据处理 PCR 扩增产物使用 ABI 3730 XL 测序仪（华大基因公司）双向测序，测序后得到正反两向峰图，利用 Codoncode Aligner V 6.0.212进行峰D 的查看、拼接及比对。当目的序列低于 800 bp 时，需去除拼接后的引物序列，但引物序列均在前 30 bp 和后 30 bp 的 不稳定区且拼接后的长度也不相同，故在去除引物区这一步骤需手动去除不稳定的引物区。 实验所测序列拼接后的序列长度在 690710 bp，陈士林13用 COI 基因通用引物测得中国 林蛙序列为 658 bp，均低于 800 bp，需
14、手动去除拼接后的引物区。对于从 Genbank 获得的 COI 序列，采用 Codoncode Aligner v 6.0.2 软件，与拼接好的样品序列比对后，去除与样品 序列相对应的 658 bp 以外的区段。所有序列应用 MEGA 7.014软件比对并计算 K2P 遗传距离15、建立 NJ 系统聚类树16，在 GenBank 上进行 BLAST 相似性搜索法17-18进行 序列的比对分析，验证各物种。 3 结果与分析 3.1 PCR 扩增 中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙江林蛙进行 PCR 时，中国林蛙退火温度为42 ，电泳样本 10 个，成功 10 个（110） ；桓仁林蛙退火温度为
15、42 ，电泳样本 10 个， 成功各 10 个（1120） ；东北林蛙的退火温度为 37 ，电泳样本 75 个，成功 37 个 （2157） ；黑龙江林蛙的退火温度为 35 ，电泳样本 30 个，成功 2 个（5859） ；以上 所有成功的条带均在 500750 bp 出现亮带。这表明，中国林蛙和桓仁林蛙 DNA 条形码获 得条件通用，便于实践中应用，而东北林蛙和黑龙江林蛙不仅反应条件独特，而且成功率 极低，分别为 49%，6.7%，对于实践应用基本没有参考价值，见图 1。 3.2 种内和种间变异分析 3.2.1 中国林蛙 中国林蛙 10 条序列比对后序列长度为 658 bp，平均 GC 量为
16、 322， 占 48.9%。种内最大 K2P 距离为 0.002，种内平均 K2P 距离为 0.001。中国林蛙与桓仁林蛙、 东北林蛙、黑龙江林蛙的种间遗传距离分别为 0.022， 0.085，0.107；种间分别有 24，85，101 个不同的碱基；种内有 1 个变异位点，在第 448 位点有 C/T 变异，见图 2。 3.2.2 东北林蛙 东北林蛙 37 条序列比对后序列长度为 658 bp，平均 GC 量为 325， 占 49.3%。种内最大 K2P 距离为 0.011，种内平均 K2P 距离为 0.003。东北林蛙与桓仁林蛙、 黑龙江林蛙的种间遗传距离分别为 0.081，0.115；种间分别有 81，108 个不同的碱基，种 内有 A/G，G/A，C/T，A/C 等 8 个变异位点，见图 2。 3.2.3 桓仁林蛙 桓仁林蛙 10 条序列比对后序列长度为 658 bp，平均
