实时荧光定量PCR的原理与应用

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1、第六章 第二节实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量技术的应用实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR 原理 实时原理 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PC

2、R扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析荧光PCR及特点1、荧光PCR 就是在利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程动力学曲线。实时荧光PCR带来的好处是熟悉传统方法的人所无法想象的! 2、特点 闭管方式进行，操作简便，杜绝了产物污染源 非平台期检验，重现性好 利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性 扩增检测合二为一，降低了传统方法过多人为因素的影响，使检测的自动化水平大幅提高 实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct

3、值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（ baseline），即样本的荧光背景值和阴性 对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99q 真正的

4、信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数C(t) value Ct值（Threshold Cycle ） C代表Cycle ，t代表threshold： PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长的拐点处附近。 Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设到达设定的域值时所经历的循环数定的域值时所经历的循环数。PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 （

5、终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性) Ct值的特点：Ct值则极具重现性Ct值的确定实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率800免费电话：800-810-2177 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与 模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数 就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈 线性关系，根据样品的Ct值 就可计算出样品中所含的模 板量Th

6、reshold104103102实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线 标准曲线：模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Ct与起始模板量的对数呈反比反比关系。 PCR扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的Ct值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算未知样品的起始模板浓度。荧光定量标准曲线 qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量25提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧

7、光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用非特异性荧光标记：1、 SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记实时荧光定量PCR 方法 -以SYBR Green 法为例SYBR Green SYBR Green法工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形

8、成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。SYBR Green 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo Emission SGSGSG ExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitation实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR

9、 Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化求导。(- (- dI/dTdI/dT) )-dIdTTmSYBR Green 法 融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确非特异性产物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少q Log模板DNA浓度与循

10、环数呈 线性关系，根据样品Ct值，就可 以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不 易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBR Green 法 应用范围q 起始模板的测定q融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二

11、聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green 法 优缺点 q 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNAq 使用方便-不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR法 标准样品相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组

12、中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA 实时荧光定量PCR法 定量方法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到 标准曲线q 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间 基因的表达差异（不同时相）实时荧光定量PCR法 绝对定量方法实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例TaqManTaqMan法研究法研究ERBB2 ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异TaqMan法举例 标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q Fam标记目标基因探针 q VIC标记看家基因探

13、针TaqMan法举例 材料准备q从正常乳腺组织中提取的总 RNA q从乳腺癌组织中提取的 总RNA q含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 q单双通道同时进行，独立分析qq ControlsControls no RNAno RNA：阴性对照阴性对照 RNA + no reverse transcriptaseRNA + no reverse transcriptase：基因组对照基因组对照TaqMan法举例 癌症标记物表达Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqMan法举例 实

14、验结果 定量Copies ng/ l Total RNAHealthy RNATumor RNATumor/ HealthyERBB21095 10522130 24922.16 XGAPDH95500 85730136000 1308001.45 XTaqMan法举例 实验结果 定量分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.0115GraphCopies ng/ l Total RNATaqMan法举例 实验结果 表达差异Healthy TissueCarc. TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqMan法举例 实验结果 讨论通过RT-qPCR成功检测了ER