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1、紫杉醇 现代天然药物研究开发的典范植物化学第十四讲海洋学院 何 山紫杉醇研发史时间进 展1958NCI开始大规模植物药研发筛选1967 发现红豆杉提取物的抗癌活性1968 从红豆杉中分离出紫杉醇 1971 完成结构鉴定1979 发表作用机制1983 临床试验1985 临床II期1991 临床III期1992 FDA批准上市 短叶紫杉Taxus brevifolia紫杉醇的化学结构英文名：Paclitaxel, Taxol分子式：C47H51NO4 二萜类化合物M.C. Wani et al. The Isolation and Structure of Taxol, a Novel Antil
2、eukemic and Antitumor Agent from Taxus breoifolia. Journal of the American Chemical Society 1971, 93, 2325.XRDXRD独特的抗肿瘤作用机制微管是真核细胞的一种组成成分， 它由两 条类似的多肽为单位构成的微管蛋白二聚体 形成。微管具有构成细胞网状支架， 维持 细胞形态，参与细胞运动，参加细胞器的位 移及胞内物质运输等功能，尤为重要的是染 色体的分裂和位移，均需在微管的帮助下进 行。 正常情况下，微管蛋白和组成微管的微管蛋白二 聚体存在动态平衡。紫杉醇可使二者之间失去动 态平衡,导致细胞在有
3、丝分裂时不能形成纺锤体 和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停 止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗癌作用 。 该作用机制与秋水仙碱、鬼臼毒素等抗肿瘤药物 抑制微管蛋白聚合的作用正好相反。 P.B. Schiff et al. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature 1979, 277, 665-667.紫杉醇的应用紫杉醇是过去数十年里最好的天然抗肿瘤 药物之一， 由于其独特的作用机制使之成 为继环磷酰胺、阿霉素、顺铂后又一重要 的抗肿瘤药物。 它具有独特抗癌活性，作为晚期卵巢癌的 治疗药，至今已在40多个国
4、家获准上市， 是目前治疗乳腺癌和卵巢癌的特效药。紫杉醇应用的限制(1)药源紧张。 (2)水溶性低，口服生物利用度差。 (3)助溶剂聚氧乙烯蓖麻油容易引起不良 过敏反应。 (4)紫杉醇本身引起的毒性反应，如神经 毒性。解决这些问题是全球科学家过去、现在以及将来奋斗的目标！市场需求 抗癌一线用药抗癌一线用药销售额销售额年增长率5亿美元 理论需求量理论需求量2g /人, 500万人/年1000kg/年 实际销量实际销量350 kg/年紫杉醇供需相差十分悬殊！紫杉醇供需相差十分悬殊！ 图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）紫杉醇价格100公斤紫杉醇大约能治疗5万
5、多个肿瘤病人，国际市 场上1公斤紫杉醇的最低价格是26.5万美元。进口：紫杉醇注射液(百时美-US) 30mg/ml 1329.93元 平均每个病人费用约88000元国产：紫杉醇注射液(京双鹭) 30mg/ml 163.87元 平均每个名人费用约10000元 前体药物：与其他化合物交联形成无活性，水溶 性佳的衍生物 ，在体内经酶解或水解后解离出活 性药物。 糊剂：选择生物相容性聚合物 ，制成外用糊剂 ，亦可实现紫杉醇局部用药，具有持续缓释作用。 脂质体：利用脂质体包裹技术，靶向性，缓释作 用，降低药物毒性，提高稳定性。 紫杉醇纳米粒：不含聚氧乙烯蓖麻油的注射用紫 杉醇白蛋白纳米悬浮液。紫杉醇和
6、白蛋白结合的纳 米微粒，形成肿瘤间质中有较高的药物浓度从而增 加紫杉醇化疗疗效。紫杉醇新剂型开发红色：活性必需基团 蓝色：最易修饰基团紫杉醇的构效关系与结构改造David G.I. Kingston. Taxol: The chemistry and structure-activity relationships of a novel anticancer agent. Trends in Biotechnology 1994, 12, 222-227.紫杉醇的来源紫杉又名红豆杉、赤柏松 ，为紫杉科紫杉属长绿针 叶乔木，是世界珍稀濒危 物种，国家一级保护植物 。因其药用价值巨大，世 界各国将
7、其列为“国宝” ，素有“植物黄金”之称 。目前在我国共有4个种和 1个变种，即云南红豆杉、 西藏红豆杉、东北红豆杉 、中国红豆杉和南方红豆 杉（变种）。但在我国资 源并不丰富。红豆杉怀璧获罪紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中 也仅含0069。红豆杉生长缓慢，树皮剥去后不能再生，树木将死亡。 如果以红豆杉树皮为原料，每提取1公斤紫杉醇就要活剥10吨树皮！美国的 太平洋红豆杉资源比中国多，早在1992年美国政府就颁布法令，砍一棵红 豆杉罚款1万美元。由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等国家。 在中国，的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量
8、最高 。 年，民营企业云南汉德公司成立，其主要业务是从红豆杉中提 取 紫杉醇。年，汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术，建成 了中国最大的年生产能力公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。 年月，该厂的产品还通过了美国认证，“顺利扫清了通向美国 市场 的障碍”。 云南省人民政府生物资源开发创新办公 室的资料说，汉德公司的紫杉醇 年出口 量为公斤（公斤紫杉醇需 用树皮吨）。目前 ，中美合 资的汉德生物技术开发有限公司已被云 南省列为生物资源开发、出口创汇的骨 干企业，备受各方重视。年底 ，该公司与美国签订了价值亿多元的 供货合同。在中国，获得紫杉醇产品开 发权的还有北京协和制药厂。从1992年到200
9、1年，将近10年时间， 云南红豆杉遭到了毁灭性的破坏，分布 在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉 ，绝大部分被剥了皮（有调查数据认为 是92.5%），现正在慢慢死去。红豆杉 生长缓慢，要上百年才能成材，而1公 斤树皮只卖5元钱。 1994年，中国医学科学院药物研究所有关专家会同中国 科学院的专家，在一次保护野生红豆杉资源专题会议上 向林业部建议我国亦应颁布保护这种野生资源的法令。 1995年野生红豆杉被列为国家一级保护植物，相当于“ 植物中的大熊猫”，严禁砍伐。 从自然资源中提取药物，造福患者，本是件治病救人的 好事，但如何在药物开发和保护自然资源之间寻求平衡 ，这是我们今天必须面对的现实问题
10、。 ？紫杉醇的药源解决途径合成生物学内生真菌发酵植物细胞培养化学半合成化学全合成紫杉醇1. 化学全合成紫杉醇分子结构复杂,具有特殊的三环6+8+6碳架和桥头双 键以及众多的含氧取代基。其全合成引起国内外许多有机化学 家的兴趣。先后共有30多个研究组参与研究,实属罕见。经20 多年的努力,于1994年才由美国的R.A.Holton与K.C.Nicolaou 两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。后来,S.T.Danishefsky(1996年)、P.A.Wender(1997年)、 Mukaiyama(1998年)和I.Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这 一工作。6条合成路线虽然各异,
11、但都具有优异的合成战略,把 天然有机合成化学提高到一个新水平。(2) Nicoloau路线-会聚式：A环和C环 八元B环，得到 ABC三环化合物。 (3) Danishefsky路线-会聚式：D环与A和C、D环片段连 接，合成八元B环。(1) Holton路线-线性途径：AABABC。反应步骤多达数十步 大量使用手性试剂反应条件极难控制制备成本昂贵具有重要的理论意义不适合大规模工业生产2. 化学半合成 母核：红豆杉针叶中提取BaccatinIII（R=Ac）和 10-去乙酰基巴卡亭III（10-DAB，R=H） 侧链：化学合成侧链： (2R,3S)-3- N-苯甲酰苯异丝氨酸避免了合成紫杉醇复
12、杂的母环部分！ 化学半合成比天然提取成本低，且对环境生态较友好， 目前已经成为紫杉醇的主要来源！3. 植物细胞培养90年代，Phyton克服细胞培养过程 的各种技术障碍，突破细胞培养生 产紫杉醇技术，生产过程得到FDA 认证；2002年7月10日-Phyton, Inc.与 Bristol-Myers Squibb 签署长期 合作协议用细胞培养生产紫杉醇；2004年6月28日Bristol-Myers Squibb 获总统绿色化学挑战奖。愈伤组织培养 愈伤组织的继代培养悬浮细胞培养细胞大量培养4123 红豆杉外植体的处理：用自来水充分洗净，再用 70%乙醇冲洗表面后切成小块，在70%乙醇中浸泡
13、 2分钟，再转移至0.1%升汞溶液中浸泡20分钟， 然后用无菌水冲洗4到5次，备用。 愈伤组织诱导及培养：将上述无菌红豆杉嫩茎小 块组织接种于含2ppm的2，4-D、0.5ppm的KT及 10%椰乳的MS培养基中，于25摄氏度的二氧化碳 培养箱中培养40天，PH5.8,即可形成小的愈伤组 织块，然后每隔30天进行一次移植继代培养。每 次移植继代培养均取一块愈伤组织，不另其混杂 ，如此多次移植继代培养即可获得多个愈伤组织 无性系。 细胞悬浮培养：培养基为含1ppm的2，4-D、 0.05ppm的KT及10%椰乳的B-5培养基 红豆杉细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培 养基相同。在反应器中加入培养液
14、，灭菌后 冷却至室温，接种已经培养30天的悬浮培养 细胞，接种量按干细胞1到2克每升，在25摄 氏度下，培养30天，待收获细胞。 细胞干燥及收集：每批细胞培养30天后，离 心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤两到三 次，每次抽干，然后于30至40摄氏度低温下 真空冻干，即得红豆杉培养细胞成品。诱导子:稀土铈离子/真菌多糖/甲基茉莉酸 培养策略:前体饲喂4.内生真菌发酵发现历史： 1993年，美国蒙大拿州立大学的植物病理学家Strobel 和化学家Stierle在短叶红豆杉的韧皮部中发现了一种 内生真菌（Taxomyces andreanae），它能够自主产 生紫杉醇。为紫杉醇的生产提供了一条新的途
15、径。 1996年，从西藏红豆杉小枝的内皮层中分离得到的内 生小孢拟盘多毛孢，实验证明它能产生紫杉醇。 后来，人们发现从美国南卡罗来纳州柏树的树皮中获 得的小孢拟盘多毛孢、一种土生茜草科植物中分离得 到的内生真菌也能产生紫杉醇 我国科研工作者在东北红豆杉、南方红豆杉、云南红 豆杉中均找到产紫杉醇的真菌内生真菌发酵生产紫杉醇的优势 (1) 生产的可重复性，在工业上可用发酵罐大规模进行 生产，内生真菌生长迅速，易于培养，易于缩短生 产周期，可满足市场的需求，降低紫杉醇的价格； (2) 微生物的发酵生产不需要特别的技术； (3) 微生物育种和选育速度会明显高于植物细胞株； (4) 在药厂利用微生物规模
16、化发酵生产的技术比较成熟 ，微生物发酵法生产紫杉醇的转产风险明显小于细 胞培养法与化学合成法； (5) 生物多样性丰富：到目前为止，人们已发现了20多 个属内生真菌可以产生紫杉醇，其寄主也不仅限于 红豆杉属植物，从而提供了丰富的研究对象。优化发酵培养条件诱变改良菌种进行耦合培养提高真菌产紫 杉醇产量！构建基因工程菌(1) 优化发酵培养条件通过添加碳源、氮源和前体物、特殊的诱导子、抑制剂等物质 借助代谢途径工程的研究来提高真菌紫杉醇的合成量。2007年，代文亮等人，采用响应面法对美丽镰刀菌发酵合成紫 杉醇途径中一些可能的前体进行优化研究。在优化条件下紫杉醇的 产量达到242.6g/L,较前体单因素实验最高值
