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1、第四章 目的基因的分离与合成n通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”n将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。n获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物，另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功能的研究 Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第四章 目的基因的分离与合成n获得目的基因的方法：n限制酶直接分离n从基因组文库中筛选n逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选n人工合成nPCR扩增n基因改造 Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第四章 目的基因的分离与合成第一节
2、限制酶直接分离 一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物 基因的制备n对已定序列的DNA分子 只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯 化所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得 到目的基因的克隆。n对已知定位的目的基因 只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一 次即可获得目的基因。Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第一节 限制酶直接分离二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备采用鸟枪法（shot gun）：n从细菌细胞中分离细菌染色体n用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段n用相同
3、的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞n转化子的选择Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新A 鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离 Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平
4、头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法操作的
5、改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kbDate
6、苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术 Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构*苏州科技学院生物系 叶亚新基因文库的基本概念基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同
7、，基因文库分为： cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 第二节 建立基因组文库Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库第二节 建立基因组文库Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库的完备性基因文库的完备性
8、是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆第二节 建立基因组文库Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高
9、的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体DNA
10、的长度一般在100 kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库的构建程序基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根
11、据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新基因文库的构建程序载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体l-DNA由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒10 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物
12、系 叶亚新叶亚新第二节 建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤1、利用噬菌体n获得目的基因的DNA片断n基因组DNA片段化的方法n物理学方法：机械力和超声波n生物化学方法：限制酶（四个核甘酸序列识别位点的酶）n与噬菌体克隆载体重组，体外包装成噬菌体颗粒n转染宿主菌n筛选培养Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新不完全补平和磷 酸化处理可抑制载体 臂的自身连接，大大 减少基因组DNA片段 插入同一重组体的可 能性Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第二节 建立基因组文库三、建立基因组文库的主要
13、步骤2、利用Cosmidn基本与用噬菌体载体构建基因组文库相似。n有如下不同：n制备基因组DNA须特别小心必须保证DNA分子尽可能大n载体的处理比较简单n连接重组时，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上n包装转染后在平板上出现的转化菌落，不是嗜菌斑Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第二节 建立基因组文库三、建立基因组文库的主要步骤3、利用YACn选用限制酶EcoRI和BamHI对pYAC4载体作双酶消化n选用适当的方法制备生物体完整的染色体DNA，并将其片段化n收集纯化大片段DNA，并与YAC臂连接n转化
14、去壁酵母细胞，利用存在于两臂上的选择标记，筛选含有YAC两臂的酵母细胞Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第三节 cDNA基因文库的构建一、cDNA基因文库的概念n某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库ncDNA序列只与基因的编码序列有关，不能反映基因的内含子，也不能反映基因的转录启动子、终止子等非转录序列ncDNA基因文库可分为表达型和非表达型n表达型cDNA文库的构建：gt11n非表达型cDNA文库的构建：gt10
15、Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新第三节 cDNA基因文库的构建二、cDNA基因文库的构建n细胞总RNA的制备及mRNA的分离ncDNA第一条链的合成n双链cDNA的合成ncDNA与载体的连接，重组到相应的载体上，导入受体 细胞增值Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新二、cDNA基因文库的构建n细胞总RNA的制备及mRNA的分离n总RNA：mRNA、tRNA、rRNAnmRNA的分离纯化n利用真核生物mRNA其3末端的poly（A）尾巴与oligo（dT）配对特性，制备oligo（dT）型纤维素亲和层析柱Date苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系
