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1、第三章 植物组织培养技术-灭 菌方法、无菌操作技术内容：灭菌无菌操作愈伤组织的分化与再分化、脱分化形态发生教学目的要求1掌握外植体的选择条件与消毒方法；2掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件；3了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成 过程、形态发生的调控方法，掌握愈伤组织 的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织 培养的基础技术。4一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程 （选修）；掌握离体茎培养的种类和操作步 骤；本节教学重点、难点：重点：无菌操作技术；组培苗的培养难点：无菌操作技术第一节 外植体的选择和消毒一、外植体的选择选取性状优良的种质或特殊的基因型 1.选择健壮的植株 ： 健壮、无病虫
2、、发育正常代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功 2.选择最适的时期 ：旺盛生长期注意植物的生长季节和生长发育阶段：茎尖、花蕾、嫩叶生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多 ，不易消毒而难以培养成功。 3.选取适宜的大小 ：一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织， 甚至难于成活 外植体（叶）的各个部分其芽、苗再生能力也很不相同 胶皮枫香树（Liquidamnbar styraciflua “Variegata”）叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响外植体 部位每个外植体形成不定芽分生组织的数目由
3、培养基上增 殖苗中的叶片由温室生长2年的完 整植株上的叶片叶 柄 叶 片 总 数6.7 8.0 14.76.7 50.3 57.0外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中，实验用外 植体数为70二、灭菌与消毒（一）有菌和无菌的范畴有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体 ，它的表面都是有菌的。无菌的范畴：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。菌类：细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点：极小，肉眼看不见；无处不有，适应能力强；繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不 再发
4、生危害作用的过程。（二）常用的灭菌与消毒方法灭菌方法： 物理方法：如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波 、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等 灭菌措施； 化学方法：使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理，以达灭菌效 果。1.湿热灭菌（培养基）高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外 溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也 随之增加。在o1MPa的压力下，锅内温度达121。在此 蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。常用方法：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O 05MPa
5、时，关电源，打开放气阀，放出空气，待压力表指 针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到 01MPa开始计时，压力01-015MPa，20min。注意：1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。2、完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸 气，灭菌才能彻底。2.灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）镊子、剪子、解剖刀等： 浸入95%的酒精中 酒精灯火焰上灼烧灭菌 冷却后，立即使用。3.干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）利用烘箱加热到160-180C的温度（持续 90min）来杀死微生物。 注意： 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为 包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料
6、。 2、灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对 流和穿透； 4、到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱， 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点：干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 4.过滤灭菌（不耐热的物质 ）对象：不耐热又不能用高压灭菌处理的 制剂。如：一些生长调节剂，如赤霉素 、玉米素、脱落酸和某些维生素等。滤膜网孔直径：0.45m以下，当溶液通 过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。5.紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌 紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌 能力最强，要求距照射物以不超过1.2
7、m为宜。 (2)熏蒸灭菌使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便，空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂：高锰酸钾、甲醛。常用方法：房间关闭紧密，按58mlm3用量，将 甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时，房间可预先喷湿以加强效果。6.喷雾灭菌（物体表面）70%75%的酒精l%-2%的来苏儿溶液 涂擦、喷雾0.25%1%的新洁尔灭（桌面、墙面、双手、植物材料表面等）7.植物材料表面用消毒剂灭菌第一步：1、将采来的植物材料除去不用的部分，仔细洗 干净。2、切割成适当大小（即灭菌容器能放人为宜 ）。3、置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时 （可加入
8、 洗衣粉）。第二步：是对材料的表面浸润灭菌。1.准备工作： 准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%75%酒精、 消毒液、无菌水、手表等。2.酒精浸润消毒： 用70%酒精浸1030s。70%酒精穿透力强，也 很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。3. 化学灭灭菌剂处剂处 理 消毒剂消毒原理： 利用氯气、重金属、原子态氧来杀菌。灭灭菌剂剂使用浓浓度 (%)持续时续时 间间（min ）去除的难难 易效果次氯氯酸 钙钙910530易很好次氯氯酸 钠钠2530易很好氯氯化汞0.1158较难较难最好抗菌素450mg/ L3060中较较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表第三步.无菌水涮洗是免除消毒剂杀伤植物细胞的
9、副作用。灭菌后用无菌水涮洗34次即可；升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗610次。第二节 外植体的接种和培养 一、无菌操作：经过必要消毒的操作者在严格灭菌 的操作空间(接种室、超净台等)使用消 过毒的器皿所进行的操作。（一）无菌操作步骤（实验课 ） (1)接种室消毒：在接种前用甲醛熏蒸接种室，在接种前20min， 打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯 (2)摆放接种用具：将培养基、接种用具等分别防入小推车或超净 工作台上(无菌水.镊子.解剖刀.酒精棉.酒精灯.培养皿.小烧杯等) (3)进入接种室：接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服， 并换穿拖鞋等； (4)手及台面消毒：用70%酒精棉
10、球擦拭双手，特别是指甲处。然 后按一定顺序擦拭工作台面； (5)培养材料灭菌：将接种材料预先放入烧杯，置入超净台进行表 面消毒。 (6)接种用具灭菌：先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子 浸泡在95%酒精并取出从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。注：接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳 嗽等；若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。（二）接种技术 （实验课）1. 消毒：将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再 用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸
11、上。2. 取材：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切 割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。在接种过程 中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。3. 接种：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。接种后 ，将管口在火焰上再灼烧数秒钟，盖上瓶盖。具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近 酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊 子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在 培养基上，以放13块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端 向上)外，其他尚无统一要求。
12、4. 标记：注明接种日期、培养基编号等。第二节 外植体的接种和培养二、培养：指把培养材料放在培养室(适宜光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或再生植株的过程。 1培养方法(1)固体培养法用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。优点：设备简单，操作易行。缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中 毒现象发生。(2)液体培养法用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。优点：能均衡提供养分。缺点：透气性较差。通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧 气的供给；速度：一般为50-100rmin。滤纸桥方法2培养步骤(1)初代培养即接种某种外植体后，最初的 几代培养。目 的：获得
13、无菌材料和无性繁殖系。 培养基：常用诱导或分化培养基，即培 养基中含有较多的细胞分裂素和少量的 生长素。2培养步骤(2)继代培养（扩繁培养）是继初 代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无根苗，最后能 达到边繁殖边生根的目的。 扩繁的方法：切割茎段、分离芽丛 、分离胚状体、分离原球茎等。2培养步骤（3）生根培养生根培养目的：使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养基：可采用12或者1/4MS培养基，降 低全部去掉细胞分裂素，并加入适量的 生长素(NAA、IBA等)。3、培养过程中常出现的 问题及解决方法 （第四章 植物组织培养中常见问题及解决办法）A.培养外植体的污染B.初代培养
14、外植体的褐变C.继代培养时材料的玻璃化初代4.植物组织培养的环境条件在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。 温度(temperature) 一般采用25 2。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高 于35时对植物生长不利。不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20 、月季足25-27、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影 响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。光照(light)主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 1光
15、照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的 研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响 。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱 幼苗容易徒长。 2光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显 的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。 但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种 15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白 光下幼苗纤细。 3光周期(light period) 最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明，
16、一些植物的愈伤 组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 湿度 (humidity)实验室环境的相对湿度：一般要求70%80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进 行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。培养容器内的相对湿度：100%相对湿度渗透压(penetrating pressure)12个大气压对植物生长有促进作用。 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此， 影响到渗透压的变化。2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用 。56个大气压植物生长就会完全停止。6个大气压植物细胞就不能生存
