《细菌内毒素检测方法介绍》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌内毒素检测方法介绍（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细菌内毒素检测方法介绍上海市兽药饲料监察所 刘雅妮 2006年11月内 容v基本概念v实验方法v操作注意事项一、概念及相关知识v热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、 寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等 症状。v热原：任何可以导致肌体发热的物质。v机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。外源性 热原质吞噬性 白细胞内源性 热原质体温调节 中心发 热新蛋白 合成新mRNA 翻译v1942年，美国药典首次收载热原检查法，中 国药典自第一版（1953年版）起收载。v所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都 要经过热原检查。v热原检查法的局限性：1、重现性差。2、对药物引起的增加、抑制作
2、用无法控制。3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。4、非定量反应。v虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内 毒素是最主要的热原物质。v细胞壁结构：肽聚糖 脂蛋白 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜磷壁酸 脂多糖v细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中 的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整 时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多 糖脱落才显示出内毒素活性。v脂多糖结构：多糖O抗原核心多糖类脂A致热活性部分v内毒素的量值： 1、内毒素单位（EU）1982年FDA将当时美国代号为EC2的内毒 素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位 （EU）被USP正式引用。 2、国际单位（IU）WHO
3、先后两次组织协作标定，建立内毒素 国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品 适用于所有内毒素检查法，且明确1IU1EU 。v鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节 肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及 两广的沿海一带。v鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解 液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种 细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成 特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程 度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的 敏感试剂。鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子凝胶B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应细菌内毒素检查法凝胶法 浊度法光度法显色基质法重现性好能定量
4、能控制药物的增强/抑制干扰操作简便。节省时间方法 分类方法 特点二、细菌内毒素检测之凝胶法v实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品内毒素限量检查v实验材料及用具 1、仪器名称要求 天平感量0.1mg以下 电热干燥箱300 恒温水浴箱371 水银或酒精温度计100 1 漩涡混合器/ 计时器60min1min 2、器具 器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径1075mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜
5、、记号笔v试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、三效热原灭火剂 5、75乙醇v常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值v灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进 行灵敏度复核。 试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支；待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶 壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75 酒精擦拭后启开，加1mlBET
6、水溶解，封口膜封住， 置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下( 箭头下方为加入BET水量)：100EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.8ml0.2ml1.8ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml 0.9ml 0.9ml0.9ml 0.9ml0.2ml0.2ml0.9ml0.9ml0.9ml0.9ml水水溶解后的标准品水水水水100 EU/ml10 EU/ml1 EU/ml0.5 EU/ml0.25 EU/ml0.125 EU/ml0.0625 EU/ml（2 ）（ ）（0.5 ） （0.2
7、5 ）2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支， 每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于 0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解， 再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm75mm） ，将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶 液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。1 22 3 0.54 0.25BET水22220.50.50.50.50.250.250.250.25v反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口， 轻振动混匀，置37 水浴中保温602min，将 每管拿出缓缓倒转180，凝胶不变形为“ ”，凝胶不能保持完整为“
8、”。当2.0四支管都为阳性，0.25四支管都为阴 性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵 敏度c ：clg-1(X/4) （X:反应终点浓度的对数值。）当0. 5c 2.0时，鲎试剂灵敏度复核合格 ，检测时仍以标示灵敏度为准。举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度为0.125EU/ml:平行 管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终 点浓度CX (lgC)0.250.1250.060.03 1+-0.06-1.22 2+-0.125-0.903 3+-/0.125-0.903 4+-/0.125-0.903 clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（-0.903）（ -1.22 ）（ -
9、1.22 ）/40.104（EU/ml）c在0. 52.0范围内，符合规定。v样品内毒素检查 1、供试品最大有效稀释倍数的计算：CLMVD ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。 L：供试品细菌内毒素限值。 C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。 当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml； 当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的 单位为mg/ml或者u/ml。2、供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVD 。含2内毒素标准品的供试品溶液（PPC）的制备：3、加样：取鲎试剂8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2 支为样品管，加入样品液0.1ml；2支加
10、入阴性对照 管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2 2浓度的内毒素标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性 管，加入0.1ml含2内毒素标准品的样品溶液。371水浴中保温601min。稀释0.5MVD倍 的供试品1.0ml4浓度的内毒素 标准品溶液1.0ml混合含2内毒素的 供试品溶液示意图：v结果判断：阳性对照为阳性阴性对照为阴性 试验结果成立样品阳性对照为阳性2支样品管均为阴性时，样品符合规定；2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；样品管1支为阳性1支为阴性时，需复试。复试时做4支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。样品阳性阴性样品阳性例：硫酸庆大霉素注射液 规格：4000U/
11、ml 内毒素限值L：参考兽药典“每1000庆大霉素单位含 内毒素的量应小于0.5EU”，即L0.5EU/1000U=0.0005EU/U 鲎试剂标示灵敏度：0.125EU/U供试品最大稀释倍数CL 4000U/ml0.0005EU/UMVD 160（倍） 0.125EU/U 供试品溶液制备：含2内毒素标准品的供试品溶液的制备： 取500U/ml的样品溶液1.0ml0.5EU/ml的内毒 素标准品溶液混合。供试品4000U/ml1000U/ml500U/ml250U/ml0.4ml3.6ml1.0ml3.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml稀释10倍稀释40倍稀释80倍稀释160倍用量
12、多结果判断：结果判断样品管阴性 对照阳性 对照样品阳 性对照符合规定不符合规定需复试符合规定不符合规定三、操作注意事项v试验前准备： 1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确 、清洗操作方便。 洗净 去污去内毒素 去洗涤剂 精洗 除外源性热原：250 干烤至少1小时。 2、尽量用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水 冲洗后250 干烤至少1小时。 3、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管 ；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。v实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进 行，保证环境温度、湿度及通风稳定。v实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75酒 精棉球消毒，戴工作帽和口罩。v实验过程： 1、内毒素
13、工作标准品应严格按要求低温保存； 工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完 ，不再保存。 2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振荡 器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步均 应在漩涡混合器上混匀30s。振荡前振荡后内毒素分子在水溶液中的状态3、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉 使用。 4、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入， 避免产生气泡。 5、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实 验结果，故操作应尽量熟练、快速。 6、恒温器的温度变化应1，鲎试剂与样品混 匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在 602min，保温期间不得移动试管架，桌面保 持平稳，周围不能有振颤因素。 7、使用的试管为10mm75mm，10为试管外径。v结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶 缓缓倒转180，不从管壁脱落为阳性，不能 保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。v其他：试剂购买。
