血清蛋白质浓度定量测定

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1、BCA 法定量蛋白质浓度nBCA法是近来广为应用的蛋白定量方法 。n操作简便，快速，灵敏度高，准确，试 剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为 Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物 ，测定其在562nm处的吸收值，并与标准 曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。【原理】：基本原理nBCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定 量：n在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将 Cu2+还原成Cu+（biuret reaction）。 BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物 ，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白 质浓度成正比，据此可测定蛋白

2、质浓度。 n【试剂】n1、 试剂试剂 A：n分别别称取10g BCA二钠盐钠盐 、20g无水碳酸 钠钠、0.16g酒石酸钠钠、4g氢氢氧化钠钠 、9.5g 碳酸氢钠氢钠 ，混合调调PH值值至11.25，加水至 1L。 n2、 试剂试剂 B：4硫酸铜铜。 n3、 BCA工作液：n试剂试剂 A 100ml 试剂试剂 B 2ml混合。 操作步骤n1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量 ，按50体积solution A加1体积solutionB试 剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀 。BCA工作液在24小时内稳定。n2、 蛋白质标准液：n用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度用生

3、理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 3.绘制标准曲线：n取6支试试管，编编号后分别别加入0mL、 0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、 0.1mL标标准蛋白质质溶液(BSA)，然后各管分 别别用去离子水补补充到0.1mL，最后各试试管 中分别别加入2.0mLBCA工作液，每加完一 管，立即在漩涡涡混合器上混合（注意不要 太剧剧烈，以免产产生大量气泡而难难于消除） ，以蛋白质质的蛋白含量为为横坐标标、吸光度 A为纵为纵 坐标绘标绘 制标标准曲线线。4.样品测定：同绘制标准曲线方法，在一支试管中加入待 测样品0.1mL代替标准

4、蛋白质溶液，然后加入 2.0mLBCA工作液后，立即在漩涡混合器上混 合，测吸光度A，查标准曲线，求出待测样品 中蛋白质浓度（g/L）。n【优缺点】n(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定， 比经典的Lowary法快4倍且更加方便；n(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的 蛋白质测定范围是20-200g/ml，微量BCA测 定范围在0.5-10g/ml。n(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔 中就进行，大大节约样品和试剂用量；n(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿 素等均无影响n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 n BCA蛋白

5、浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白 浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现 了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵 敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微 克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克， 待测样品体积为120微升。 试剂盒组成n2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（ 5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20保存）取10微升用 PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升（样 品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。n将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分

6、別加到96孔板的蛋白标准品孔中 ，加标准品稀释液补足到20微升。体积 (ul)02468121620终浓度 （ ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5npH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS ）的配制npH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）:nNaCI 8.0gnKH2PO4 0.2gnNa2HPO412H2O 2.9gnKCI 0.2gn将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水 溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7.4, 高压消毒 灭菌112Kpa20min，冷却后，保存于4冰箱中备用 。n6孔板底面积9.6cm2,加培养液

7、的量2.5ml,n12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,n24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,n96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,n摘自司徒镇强的细胞培养实验步骤实验步骤n3、 待测样品：用双缩脲测定法的样品 稀释而成。 n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工 作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市 面有售。 n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多 ，但是，还没有一个完美的方法。在选 择测定方法时，可根据实验要求和实验 室条件决定。n【试剂】n1、 试剂A：1BCA二钠盐 n2无水碳酸钠 n0.16%酒石酸钠 n0.4氢氧化钠 n0.95碳酸氢钠 n混合调PH值

8、至11.25。 n2、 试剂B：4硫酸铜。 n3、 BCA工作液：试剂A 100ml 试剂B 2ml混合。 n4、 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成 1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确 定） n5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。 n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试 剂盒市面有售。 n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法 。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。实验步骤n 加适当体积样品到96孔板的样品孔中， 加标准品稀释液不足道20ul。 即：将蛋白质样品作适当稀释（最好多做 几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释n 4. 各孔加入200微升BCA工作液，用加 样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气 泡影响读数），37放置30-60分钟。n冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm， 或540-590nm之间的其他波长的吸光度 ，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 n【计算】n（一） 绘制标准曲线。n（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线， 求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。n（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密 度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度 (g/L)。