胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究

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1、肿瘤学专业毕业论文肿瘤学专业毕业论文 精品论文精品论文 胃癌耐药细胞中多药耐药基因胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究上调的分子机制研究关键词：胃癌关键词：胃癌 化学治疗化学治疗 多药耐药多药耐药 p38-MAPKp38-MAPK AP-1AP-1 通路通路 分子机制分子机制摘要：胃癌为最常见的恶性肿瘤之一。由于早期胃癌的发现率低，目前收治的 胃癌多数为进展期胃癌，而单纯性手术治疗常难以根治，化疗在综合治疗中发 挥了重要作用，因此成为治疗胃癌的主要方法之一。但鉴于多药耐药(multi drug resistance，MDR)对胃癌化疗的影响，相当一部分病例化疗效果不理想。 故研究胃癌的

2、多药耐药产生机制对提高胃癌的化疗效果、延长病人的生存期有 着重要的意义。 多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时， 对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药。其中经典的分子机 制涉及 7 号染色体上的 mdr1 基因过度表达，由它编码的一分子量为 170kd 的跨 膜糖蛋白(P-gp)，能起到能量依赖性药物外排出泵功能。P-gp 是由 1280 个氨 基酸残基构成的跨膜蛋白，通过激活 ATP 泵，阻碍药物向胞内被动扩散，并可 将胞内细胞毒药物向膜外主动转动，从而产生多药耐药的作用。许多研究表明， mdr1/P-gp 与病人的化疗效果密切相关，mdr1 阳性病人生存期短、

3、缓解率低、 复发率高。因此，mdr1/P-gp 的检测可作为癌症治疗结果的预测指标，也可为 临床医生制定化疗方案提供参考依据。 研究表明，P-gp 的表达是通过转录 及转录后水平调控及各种体内外刺激而引起的应激反应，而转录因子 AP-1 可以 介导 P-gp 的表达。同时，AP-1 通路的调控非常复杂，文献报道，一些信号通 路可以激活 AP-1 的表达。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)系统作为调控细胞信号的 主要途径之一，可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等一系 列过程。研究者在一些多药耐药系的细胞中发现，MAPK 通路可以影响 P-gp 蛋 白对药物的转运，用特异性的抑制剂阻断这

4、些通路后发现 P-gp 的表达明显减少。 p38 信号途径是 MAPK 家族中的重要组成部分，经外界应激刺激而激活，故又称 为 MAPK 应激信号通路，其在全身炎性反应、细胞凋亡、休克、肿瘤转移、耐药 等方面具有十分重要的作用。因此，本课题以 p38-MAPK 途径为切入点，重点研 究其在胃癌多药耐药产生过程中的影响，并进一步揭示胃癌的 MDR 产生机制， 探索肿瘤细胞多药耐药的机理，将对肿瘤临床化疗方案的制定及耐药的逆转具 有重要的指导意义。 本实验主要由以下两部分组成： 第一部分多药耐药 基因在胃癌耐药细胞中的表达 为明确两种细胞系对化疗药物的耐药性，分别 采用不同化疗药物(5-氟尿嘧啶、

5、表柔比星、顺铂)作用于胃癌细胞 SGC7901 与 长春新碱耐药系 SGC7901/VCR 细胞中，用 MTT 法检测细胞活性，发现 SGC7901/VCR 细胞的生存率明显高于 SGC7901，提示 SGC7901/VCR 可能属于多重 耐药细胞；随后为检测 SGC7901/VCR 是否属于特异的多重耐药细胞株，我们分 别采用 Western blot 和 RT-PCR 方法在两种细胞株中检测多药耐药基因的表达 情况。结果提示无论在蛋白水平还是 mRNA 水平 SGC7901/VCR 中 mdr1 基因的表 达明显高于 SGC7901，从而进一步提示了 SGC7901/VCR 的多药耐药特性

6、。 第 二部分胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究 研究报导，在人类 的 MDR1 启动子区域包含转录因子 AP-1 的结合位点，表明 AP-1 可以间接参与调 节 P-gp 的表达；AP-1 的活化又可以抵制许多药物抗肿瘤的活性。因此我们首 先采用萤光素酶报告基因系统来检测和比较两种细胞中 AP-1 的活性。实验结果提示在 SGC7901/VCR 中 AP-1 活性明显高于 SGC7901；而 AP-1 作为 MAPK 通路的 下游靶基因，在一些耐药细胞中可以明显改变 MAPK 的表达水平，因此我们利用 Western Blot 和流式细胞仪检测和比较两种细胞中 MAPK 途径的表达

7、情况，结 果我们发现在 SGC7901/VCR 细胞中 p38-MAPK 的活性明显高于 SGC7901；为进一 步明确 SGC7901/VCR 细胞的这种特性，我们利用 DN-p38 和 p38 的特异抑制剂 SB202190 来抑制 p38 的表达后检测 ALP-1 的活性，在 SGC7901/VCR 细胞发现与 对照相比 AP-1 的活性表达明显受到了抑制；从而说明 p38-MAPK/AP-1 途径在 SGC7901/VCR 细胞中被激活了，并可能与肿瘤细胞的多药耐药的产生机制密切 相关。同时，用 2g/ml 浓度的顺铂连续 24 小时作用于 SGC7901 后用流式细胞 仪同样检测到了

8、 p38 的活性；从而进一步提示 p38-MAPK 途径与化疗耐药相关。 为进一步验证 p38-MAPK 途径是否与化疗耐药相关，我们使用 p38 的特异性抑制 剂作用于 SGC7901/VCR 细胞后检测 mdr1 的表达及 P-gp 的功能。实验结果表明， 无论在蛋白水平还是 mRNA 水平都可以看到在使用抑制剂后多药耐药基因 mdr1 的表达都有明显的下调：同时为检测 SB202190 对 P-gp 功能的影响，使用流式 细胞仪分析 Rh123 在细胞内的积聚和贮留现象，结果提示在 SGC7901/VCR 细胞 中使用抑制剂后 Rh123 在细胞内的积聚和贮留有明显的增加；本实验提示抑制

9、 p38 途径可以降低 mdr1 的表达及 P-gp 的功能。接下来我们分别使用 5-氟尿嘧 啶、表柔比星、顺铂作用于被抑制了 p38-MAPK 途径的 SGC7901/VCR 细胞中，观 察细胞形态及分析细胞的调亡的情况，结果表明抑制了 p38-MAPK 途径后可以提 高胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性。 综上所述，本课题得出如下结论： 1、在胃癌耐药细胞中多药耐药的产生与 p38-MAPK 途径的激活密切相关，而与 JNKs 和 ERKs 无明显关系； 2、抑制 p38-MAPK 途径后可以提高肿瘤耐药细胞 对化疗药物的敏感性。正文内容正文内容胃癌为最常见的恶性肿瘤之一。由于早期胃癌的发现率

10、低，目前收治的胃 癌多数为进展期胃癌，而单纯性手术治疗常难以根治，化疗在综合治疗中发挥 了重要作用，因此成为治疗胃癌的主要方法之一。但鉴于多药耐药(multi drug resistance，MDR)对胃癌化疗的影响，相当一部分病例化疗效果不理想。故研 究胃癌的多药耐药产生机制对提高胃癌的化疗效果、延长病人的生存期有着重 要的意义。 多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对 结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药。其中经典的分子机制 涉及 7 号染色体上的 mdr1 基因过度表达，由它编码的一分子量为 170kd 的跨膜 糖蛋白(P-gp)，能起到能量依赖性药物外排出

11、泵功能。P-gp 是由 1280 个氨基 酸残基构成的跨膜蛋白，通过激活 ATP 泵，阻碍药物向胞内被动扩散，并可将 胞内细胞毒药物向膜外主动转动，从而产生多药耐药的作用。许多研究表明， mdr1/P-gp 与病人的化疗效果密切相关，mdr1 阳性病人生存期短、缓解率低、 复发率高。因此，mdr1/P-gp 的检测可作为癌症治疗结果的预测指标，也可为 临床医生制定化疗方案提供参考依据。 研究表明，P-gp 的表达是通过转录 及转录后水平调控及各种体内外刺激而引起的应激反应，而转录因子 AP-1 可以 介导 P-gp 的表达。同时，AP-1 通路的调控非常复杂，文献报道，一些信号通 路可以激活

12、AP-1 的表达。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)系统作为调控细胞信号的 主要途径之一，可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等一系 列过程。研究者在一些多药耐药系的细胞中发现，MAPK 通路可以影响 P-gp 蛋 白对药物的转运，用特异性的抑制剂阻断这些通路后发现 P-gp 的表达明显减少。 p38 信号途径是 MAPK 家族中的重要组成部分，经外界应激刺激而激活，故又称 为 MAPK 应激信号通路，其在全身炎性反应、细胞凋亡、休克、肿瘤转移、耐药 等方面具有十分重要的作用。因此，本课题以 p38-MAPK 途径为切入点，重点研 究其在胃癌多药耐药产生过程中的影响，并进一步揭示胃癌的

13、 MDR 产生机制， 探索肿瘤细胞多药耐药的机理，将对肿瘤临床化疗方案的制定及耐药的逆转具 有重要的指导意义。 本实验主要由以下两部分组成： 第一部分多药耐药 基因在胃癌耐药细胞中的表达 为明确两种细胞系对化疗药物的耐药性，分别 采用不同化疗药物(5-氟尿嘧啶、表柔比星、顺铂)作用于胃癌细胞 SGC7901 与 长春新碱耐药系 SGC7901/VCR 细胞中，用 MTT 法检测细胞活性，发现 SGC7901/VCR 细胞的生存率明显高于 SGC7901，提示 SGC7901/VCR 可能属于多重 耐药细胞；随后为检测 SGC7901/VCR 是否属于特异的多重耐药细胞株，我们分 别采用 Wes

14、tern blot 和 RT-PCR 方法在两种细胞株中检测多药耐药基因的表达 情况。结果提示无论在蛋白水平还是 mRNA 水平 SGC7901/VCR 中 mdr1 基因的表 达明显高于 SGC7901，从而进一步提示了 SGC7901/VCR 的多药耐药特性。 第 二部分胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究 研究报导，在人类 的 MDR1 启动子区域包含转录因子 AP-1 的结合位点，表明 AP-1 可以间接参与调 节 P-gp 的表达；AP-1 的活化又可以抵制许多药物抗肿瘤的活性。因此我们首 先采用萤光素酶报告基因系统来检测和比较两种细胞中 AP-1 的活性。实验结果 提示在

15、SGC7901/VCR 中 AP-1 活性明显高于 SGC7901；而 AP-1 作为 MAPK 通路的 下游靶基因，在一些耐药细胞中可以明显改变 MAPK 的表达水平，因此我们利用 Western Blot 和流式细胞仪检测和比较两种细胞中 MAPK 途径的表达情况，结 果我们发现在 SGC7901/VCR 细胞中 p38-MAPK 的活性明显高于 SGC7901；为进一步明确 SGC7901/VCR 细胞的这种特性，我们利用 DN-p38 和 p38 的特异抑制剂 SB202190 来抑制 p38 的表达后检测 ALP-1 的活性，在 SGC7901/VCR 细胞发现与 对照相比 AP-1

16、 的活性表达明显受到了抑制；从而说明 p38-MAPK/AP-1 途径在 SGC7901/VCR 细胞中被激活了，并可能与肿瘤细胞的多药耐药的产生机制密切 相关。同时，用 2g/ml 浓度的顺铂连续 24 小时作用于 SGC7901 后用流式细胞 仪同样检测到了 p38 的活性；从而进一步提示 p38-MAPK 途径与化疗耐药相关。 为进一步验证 p38-MAPK 途径是否与化疗耐药相关，我们使用 p38 的特异性抑制 剂作用于 SGC7901/VCR 细胞后检测 mdr1 的表达及 P-gp 的功能。实验结果表明， 无论在蛋白水平还是 mRNA 水平都可以看到在使用抑制剂后多药耐药基因 mdr1 的表达都有明显的下调：同时为检测 SB202190 对 P-gp 功能的影响，使用流式 细胞仪分析 Rh123 在细胞内的积聚和贮留现象，结果提示在 SGC7901/VCR 细胞 中使用抑制剂后 Rh123 在细胞内的积聚和贮留有明显的增加；本实验提示抑制 p38 途径