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1、IIF IHC ICC免疫组织化学标准化第一部分 基本知识免疫组织化学的历史、现状和发展 疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理 组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。 1974年免疫组化用于病理诊断免疫组织化学已成为病理诊 断中的一种常用手段 随着免疫学和单抗技术的发展，免疫组化技术兴起 诊断免疫组化开始于70年代，发展高峰在80年代， 90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。 国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作 中普及免疫组织化学在临床上的应用(1)提高病理诊断准确性 (2)对疾病的预后和治疗的意义激素 (3)癌基因蛋白的应用 (4)对肿瘤增生程度
2、的评价 (5)微小病灶的发现微小癌，微小病灶（如羊水栓塞） (6)在肿瘤分期上的意义 (7)指导肿瘤的治疗 (8)免疫性疾病的辅助诊断 (9)病原微生物的检测免疫组化与抗体鉴定抗体上游鉴定方法:存在否?量多少?免疫印迹、免疫沉淀、免疫电泳、免疫酶连 抗体下游鉴定方法:价值体现 IIF:间接免疫荧光技术,系IF的一种,步骤很简单, 特点为敏感性好,对于低浓度抗体检出率高于以下 两种方法. IHC:免疫组织化学技术,方法不少,但具体操作基 本相同,掌握一种就够用了。 ICC:免疫细胞化学技术,同上，组织换成细胞，但 是处理方法不一样了。 下页图示免疫组化的各种方法IHC技术是目前常规病理诊断和临床
3、治 疗中必不可少的手段，按照美国FDA标准 ，IHC抗体试剂系统分三类：A类抗体进行 病理鉴别诊断，B类抗体指导临床治疗，如 ER/PR和AR，C类抗体显示临床用药的靶 细胞，要求试剂的安全性和稳定性很高， 此类抗体筛选要求有严格的内部和外部对 照。免疫组化实验涉及的几个方面1 病理医师：把握和选择，指导实验结果判定， 2 实验员：准备片子和试剂，了解基本原理 也很重要，会做也要会分析 3 组织处理 4 试剂是否可靠，实验方法是否正确 5 实验对照设立：许多实验室忽略了这个要 素。第二部分 实验技术免疫组化染色基本技术正式实验前做HE染色确认片子质量，厚度3-4um， 目的细胞形态完好，没有过
4、多的坏死、出血、变 性组织等，以免实验完毕后发现片子质量不好， 浪费试剂和物力 1 常规处理：烤片，脱蜡，入水 2 抗原修复： 3 封闭处理：封闭组织内源性酶，封闭组织非特异 性抗原结合位点，其他封闭 4 抗体反应：一抗 ，二抗，三抗 5 显色反应：DAB，AEC，BCIP/NBT 6 后续处理：复染/分化 /返兰，脱水，透明，封片 相关知识：HE染色相关知识：HE 染色 苏木素伊红染色是形态学常用的染色方法 ，取自 Hematoxyln和Eosin单词，简称HE染色，苏木素将 细胞核染成蓝色，伊红将细胞浆染成红色，显示组 织和细胞形态结构，同时将各种组织细胞成分与病 变区分开来。 HE染色是
5、临床病理诊断的方法。 HE与IHC配合可以确诊疾病相关知识：HE示意图相关知识：HE与IHC染色（一） 良好的标本制备，免疫组化成功的首要条件 免疫组化对组织和细胞标本的要求-保持所检标本原有的结构、形态；-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫 活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 免疫组化中常用的组织和细胞标本 *组织标本 *细胞标本石蜡切片 组织印片 冰冻切片 细胞涂片细胞爬片 *石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本 的方法 -最大优点是组织形态保存好，且能作连续 切片，有利于各种染色对照观察；这点对 于我们来说非常重要！ -石蜡块还能长期存档，供回顾研究。 *石蜡切片制作过程
6、对组织内抗原显现有一 定的影响，但可通过某些措施予以改善， 因而它是大多数免疫组化中首选的组织标 本制作方法。 切片的准备：APES，多聚赖胺酸 刚切的石蜡片至少在58-60 考2h以上（防止脱 片），可以放置一段时间，实验前再烤30min即 可。不可高温烤片（80 ），会导致组织抗原 氧化而难以检测。 切片保存：不可长时间室温或冰箱里保存切片， 抗原会丢失，原则上切片最多可放3个月。 背景 ：有些研究人员或技术员喜欢一次性连 续切上大量片子，然后放置保存，留做实验 常规的石蜡切片标本均用甲醛（福尔马林）固定 ，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗 原决定簇； -蛋白之间发
7、生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露， 即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复 抗原的原有空间形态。 因为石蜡片组织含有石蜡，并且组织处于脱水的 状态，所以在实验前期要进行相应处理，即二甲 苯脱蜡和梯度酒精水化（从无水乙醇逐渐下行到 75%酒精的过程， 入水） 下一步： 抗原修复 （二 ） 恰当的抗原修复，会很大程度上改变最终的 实验结果抗原修复方法 化学方法：胃蛋白酶，胰蛋白酶 加热方法-水浴加热法 -微波照射法-高压加热法 酸水解法 以抗原修复效果而言，高压法微波法化学方法酸水解 法水煮法细胞片和冰冻切片不需要抗原修复，但需要封闭步骤 微波法 *将玻片
8、放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至 95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步 骤进行。 高压法 *将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压12min，可 取得极好的效果。 *由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。 注意事项 加热后必须经过室温自然冷却2030分钟，使未折叠的蛋 白分子链恢复天然构型； *修复液最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液 ；下一步 ；封闭处理（三） 封闭处理，降低非特异性染色的必要程序 这个步骤在抗原修复之后，主要有三个封闭 如果最后的显色系统采用HRP（辣根过氧化物酶 ），则需要以0.3-3%的H2O2 封闭内源性过氧化
9、 物酶，否则组织中血液系统的细胞会干扰实验结 果 如果检测系统（二抗或者三抗）以生物素作为标 记，则需要封闭内源性生物素（有专门试剂）， 否则肝、肾、甲状腺等组织容易出现假阳性。 常规的非免疫血清（正常血清）封闭。 下一步：抗体反应（四） 抗体反应，关键在于设置适当的对照1阴性对照：抗体稀释液 2阳性对照：两个方面（阳性组织细胞、阳性抗体） 3抑制对照 4吸收对照 5自身对照（内对照） 6同型对照；同种属来源的纯IgG或其亚型 7无关对照；其他抗体在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即 可。 除一抗以外，配套的抗体检测试剂盒种类很多，这些试剂 盒本身附带有详细的操作说明，如二步法
10、、三步法等，同 时会建议如何选择配套的显色系统。 特殊类型的一抗，例如嵌合抗体，则选择特殊的配套试剂 盒或二抗。 即用型与浓缩型抗体 关于一抗的孵育时间： 37 1h 4 过夜 可以根据实际需要安排 下一步；显色反应（五） 显色系统与显色控制，决定实验效果目前最常用的显示剂显色试剂 颜色DAB 棕黄色AEC 砖红色AP-Red 鲜红色Fast-Blue 亮绿色BCIP/NBT 兰色前两种用于辣根过氧化物酶（HRP）系统 后三种用于碱性磷酸酶（AP）系统评价：AEC显色物溶于酒精和二甲苯，所以封片时不能用中性树胶，以免褪色，而只能用 甘油明胶或市售的AEC封片剂，采用该种试剂显色的片子不能长期保
11、存，不利于回顾 性研究。DAB显色较快，镜下控制比较容易，保存方便，实验结果比AEC显色者清晰，为IHC 首选显色试剂。BCIP/NBT显色系统主要用于原位分子杂交实验，免疫组化可以选用。其缺点是不能 用苏木素复染（不能染核），但是可以用其他染料代替，比如核快红等。三种显色系统效果图 左上AEC 左下BCIP/NBT 右DAB（六） 显色后处理步骤，关系片子的外观和内观 复染，分化，返兰 前面已经强调过，石蜡片子在实验前经过了脱蜡 和水化处理，即二甲苯先脱蜡，然后沿无水乙醇 逐渐到75%酒精。 实验完毕后，则必须沿着上面顺序反向走一遍， 目的是脱水和透明，使得组织细胞清晰和易于保 存，同时也去
12、掉一些附着于片子上的杂质 注意：适用于DAB和BCIP/NBT显色系统，AEC 不可（？）。 强调：整个实验过程不能干片（七） 结果判断，实验是否成功的要素 在对照实验的基础上进行判断 结合抗体和患者的资料 熟悉病理基本知识和病变特点 真阳性与假阳性 真阴性与假阴性 判断结果的基本原则 阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性 染色强度如何 间质清晰，无背景着色。 阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价：50% +（八） 完整的IHC实验报告 实验名称 抗体名称、来源、亚型、克隆号 检测的组织或细胞名称、来源、组织种属 抗体的稀释度（效价） 设立的实验对照名称 抗原修复方法 所用的试剂盒及操作方法 结果（染色强度或阳性率）及病理描述 图片（包括实验片和对照片） 操作人员、鉴定人员IHC标准化的要素 良好的标本制备，片子质量的检测 选择恰当的指标和实验方法 试剂的正确配置 适当的抗原修复方法 实验对照的正确设置 商品化试剂盒的选择 显色系统与试剂盒正确的配套 客观的结果判断 及时保存实验结果 完整的实验报告和实验记录Thanks
