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1、2015版药典无菌检查法与 微生物鉴定方法药品检验与研究所 抗生素室无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。无菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物制 品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种 方法。 无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品 或无菌器械等 进行检验的过程中，能防止微生物污染 与干扰的一种常规操作方法。 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各 类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念 ，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识即产 品通过无菌
2、检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发 现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之 ，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生 物污染风险相当高。从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器 进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不 可能对每一最小包装的产品进行检查。统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品，其局限性在 统计学上更为明显。检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检出受多种因数 的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长 时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。 污染的检出率要比实际产品的污染率低。无菌检查存在检查失误的可能性：这可能是
3、因为污染菌浓 度太低，或是污染菌生长太慢，或是因为培养基不良等原 因，在培养期间污染菌根本就不生长。产品的染菌率愈小 ，错判合格的可能性就愈大。所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时，仅依靠 最终产品的无菌检查是不充分的，局限性较大。对无菌制 品来说，生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的。2015版中国药典无菌检查法2015版中国药典无菌检查法的修订无菌检查法的方法适用性试验无菌检查法的注意事项2015版中国药典无菌检查法的修订实验环境的修订检查用培养基的修订具体修订内容实验环境的修订2010年版2015年版无菌检查： 应在洁净度10000级背景下的局 部100级单向流空气区域内或隔
4、离系统中进行。 无菌检查： 应在洁净度B级背景下的局部A级 单向流空气区域内或隔离系统中 进行。 微生物限度检查： 应在洁净度10000级背景下的局 部100级单向流空气区域内进行 。 微生物限度检查： 应在受控洁净环境下（不低于D 级）的局部不低于B级单向流空 气区域内进行。修订的依据修订依据及意义：2010版GMP附录一无菌药品和附录三 生物制品中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环 境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产 关键区的洁净环境要求！ICH：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”。2015版中国药典通则920
5、3 药品微生物实验室质量管理指导原则9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则GMP2010年版对洁净对洁净 度的规规定及确认标认标 准50100200不作规规定不作规规定290003520000D级级25501002900035200002900352000C级级555102900352000293520B级级500个的规格为1ml的注射液，表1规定接种每种 培养基的最少检验数量为20个或2（取较少者），表3规定全 量接种。直接接种法 每管培养基接种样品的量6 验证（一次）薄膜过滤法 每株菌20瓶，6株菌120瓶直接接种法 40瓶+阳性 无菌检查
6、薄膜过滤法 40瓶+ 20瓶（阳性）=60瓶方法适用性试验结果的判断：与对照管比较，如含供试品的各试验管的实验菌均生长良 好，可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一试验管的实验菌生长微弱、缓慢或不生 长，可采用增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂、 更换滤器品种等方法，重新进行方法验证。无菌检查法的注意事项培养基的要求：灵敏度检查符合规定。硫乙醇酸盐流体培养基氧化层：接种前：培养基氧化层的高度不超过培养基深度的1/5，否则须经 100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热 一次，并防止过程中污染。培养后：装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化
7、层不超 过培养基的1/2。检验方法的选择薄膜过滤法：一般采用封闭式 滤器。只要供试品性质允许， 应采用薄膜过滤法。直接接种法：适用于无法用 薄膜过滤法进行实验的品种。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与 方法适用性试验确认的方法相同。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、 中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒 性。常用中和剂比例0.1大豆卵磷脂0.11吐温80卵磷脂、吐温80及L组胺酸用于中和醛类及酚类 化合物卵磷脂及吐温80中和季铵盐卵磷脂中和氯己定吐温80中和双三氯酚及汞化合物薄膜过滤法水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜 。油类供试品，其滤膜和过滤器在
8、使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲 洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml， 以避免滤膜上的微生物受损伤。直接接种法除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供 试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基 每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高 度同方法适用性试验。 接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分 成两等份，一份置3035培养，一份置2025培养。供试品的无菌
9、检查 阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为 对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU ，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养72 小时应生长良好。供试品的无菌检查阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲 洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。培养和观察硫乙醇酸盐流体培养基置3035，胰酪大豆胨液体培养 基置2025，培养14天。逐
10、日观察记录。阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。无菌检查一次检出！培养基浑浊，培养14天后不能判断：转种至同种新鲜培养基中，培养三天，或取培养液涂片 ，染色镜检。结果判断阳性（+）阴性（-） 供试品管浑浊，即判不合格 除非能充分证明试验结果无效 ，即生长的微生物非供试品所含的微生物。设备，环境的微生物监控结果超标。 回顾实验过程，发现污染因素。鉴定微生物，确认是操作引入的。无菌试验经确认无效，可重试。实验过程监控表面监控环境菌监控手部监控环境微生物归属：约大于50的革兰氏阳性菌来自人员；30的革兰氏 阳性芽孢杆菌来自产品外包装；酒精对革兰氏阳性芽孢杆菌 无效；革兰氏阴性假单胞菌存在于
11、新洁尔灭中；丁基胶塞会 因负压而将消毒剂中的污染菌引入样品。无菌程序保障无菌检查样品前处理：分批消毒、实验（混合） 统一消毒，统一实验严格遵守外表面消毒程序：一般环境酚类 ，洁净 环境过氧乙酸+75%乙醇（无菌级）增加过程监控力度：表面菌采样、手部采样（每批 ）、动态浮游菌采样（下风口）微生物鉴定微生物鉴定指导原则(通 则 9204)：为非无菌药品微生物限 度控制菌检查中疑似 菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制 药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供 指导。当微生物的鉴定结果有争议时，以 伯杰氏系统细菌学手 册 Bergey s Manual of Systematic Bacter
12、iology 现行版的鉴定结果 为准。微生物鉴定微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知 微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类 的区分， 或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微 生物检验中的 重要环节，药典通则相应章节中对检出微 生物的鉴定做了明 确规定，如 “非无菌产品的微生物检查 ：控制菌检査（通则 1106) ” 中选择培养基或指示培养基 上发现的疑似菌落需进 行鉴定；对 “无菌检查法(通 则 1101) ” 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判 定试验是否重试；“药品洁净实 验室微生物监测和控制指 导原则（通 则 9205) ” 中建议对洁 净室和其他受控环境
13、分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境 微生物污染情况 ，有助于污染调查。微生物分类微生物分类每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科.词尾：门：-phyta，纲：-mycetes，目：-ales，科：-aceae，亚目：-ineae，亚科：-oideae。种：是最基本的分类单位，一大群表型特征高度相似、亲缘 关系极其接近，与同属内其他种有明显差别的菌株的总称。 客观存在，相对稳定。来自共同祖先，有着相近的亲缘关系。形态、生理特征上表现十分相似。存在差异和变异。变异发展到一定程度，即形成新种或变种。变种 ：种内某一个体可能由于突变而发生变异，在自然选 择和人工选择下，这种变异会在种内不断扩散，最
14、后形成 某些遗传性不同于原种的一个群体。亚种：指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种，有时 称小种。 在微生物学中，通常把实验室所获得的变异菌株 称之为亚种。型：同种微生物彼此之间的区别不如变种显著，一般表现 在菌体的化学组分上。如：结核杆菌人型、牛型和禽型。菌株（strain）：又称品系，指一种微生物的不同 来源的纯培养物，在微生物学的研究中运用最为广 泛。从自然界中分离到的每一个纯培养物都可以称 为一个菌株或品系。自然界“种”有限，菌株无限。微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定 和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环 境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌
15、落形态 学、细胞形态学（ 杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等） 、革兰染色或其他染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键 生 化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析 ，一 般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检査一般应达到 种 属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培 养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平 ，必要时需达到菌株水平。菌株保藏中心美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）美国农业研究菌种保藏中心（NRRL）德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）英国微生物菌种保藏中心（NCTC）中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）医学微
16、生物菌种保藏管理中心（CMCC）微生物鉴定条件待鉴定的微生物必须是纯种微生物，在鉴定前，需将菌株纯化，获得纯培养物 。选取权威鉴定手册。选择适当鉴定方法，确定主要测试项目。微生物鉴定程序待检菌的分离纯化初筛试验表型微生物鉴定基因型微生物鉴定经典鉴定方法形态特征：大小，排列，分化，结构，染色等 培养特征：营养要求，生长的物理环境（酸碱 度，温湿度 ），菌落，菌苔，液体 培养特征。 代谢特征：微生物生命活动的方式。如：I.M.Vit化学组成特征：细胞主要特征性化学成分的鉴定 如：细胞 壁成分、细胞内含物 抗原特征：抗原成为化学组成的一个特殊方面，微生物具 有许多不同类型的抗原。 生态特征：与其他生物的关系、自然界的分布、致病性等待检菌的分离纯化
