急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子SDF-1测定及意义

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1、石河子大学硕士学位论文急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子SDF-1测定及意义姓名：章大谦申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：吴广胜20100501急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 I急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 姓名：章大谦（内科学） 导师：吴广胜 教授 摘 要 目的：姓名：章大谦（内科学） 导师：吴广胜 教授 摘 要 目的：通过检测趋化因子 SDF-1( stromal cell derived factor-1, SDF-1)在急性白血病患者血清及脑脊液中的变化情况，探讨其临床意义。 方法：方法：选取45例急性白血病患者，其中急性

2、髓性白血病（AML）26例，急性淋巴细胞白血病（ALL）19例，确诊中枢神经系统白血病（CNSL）患者4例；45例患者均于化疗前留取血清标本，其中40例患者在鞘内注射前留取脑脊液标本；用酶联免疫吸附双抗体夹心法（ELISA）测定急性白血病患者血清及脑脊液中SDF-1含量，同时检测其它临床相关指标，分别与20例正常对照组比较，比较血清、脑脊液SDF-1值在不同急性白血病患者中的变化情况并观察与其他临床指标的相关性。所有数据均采用SPSSl4.0统计软件分析。 结果结果：1.ALL患者组、AML患者组及正常对照组血清的SDF-1水平分别为4254.372686.58、2399.99904.66、2

3、339.85672.25(pg/ml),其中ALL组患者明显高于AML组及正常组,且差异具有统计学意义(P0.02 kPa或200mmH2O)， 或 60滴/min。 WBC0.01109/L。 涂片见到白血病细胞。 蛋白450mg/ L或潘氏试验(+)。排除其他原因造成的CNS或CSF相似的改变。 .符合及中任何一项者为可疑CNSL；符合及中涂片见到白血病细胞或任血清及脑脊液 SDF-1 检测 正常对照组 急性非淋巴细胞白血病组血清及脑脊液 SDF-1 检测；收集临床相关指标急性白血病病例组急性淋巴细胞白血病组统 计 学 分 析急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 5何

4、两项者可诊断CNSL。 .无症状， 但有CSF改变， 可诊断CNSL。 但如只有单项CSF压力增高， 暂不确定CNSL的诊断。若CSF压力持续增高，而经抗CNSL治疗压力下降，恢复正常者可诊断CNSL。应严密进行动态观察。 . 有症状而无CSF改变者，如有颅神经、脊髓或神经根受累的症状和体征。可排除其他原因所致，且经抗CNSL治疗后症状有明显改善者，可诊断为CNSL。 2.2 对照组 正常对照血清 20 例，为石河子大学一附院健康体检人员，男 10 例，女 10 例，平均年龄 47.217.5 岁。 正常对照脑脊液 20 例，为外伤后骨折手术腰麻时留取，男 9 例，女 11 例；平均年龄 47

5、.717.6 岁； 所有对照组均血象正常， 排除恶性肿瘤及血液系统、 中枢神经系统、 免疫系统疾病。 2.3 仪器和设备 1）低速离心机 （上海） 2）37孵育箱 （北京） 3）80超低温冰箱（NUNR，美国） 4）50-1000ul 加样器（GILSON 公司） 5）Elx800 酶标仪（上海） 2.4 试剂 人 SDF-1 ELISA 试剂盒由上海西唐公司提供：包括 96 微孔板（已包被抗人 SDF-1单抗）、样品稀释液、第一抗体工作液、酶标抗体工作液、底物稀释液、终止液、洗涤液（20X）、标准品、OPD 片、坐标纸。 实验中所用移液器头、离心管、烧杯、量筒、双蒸水等均经过严格灭菌，以最大

6、程度减少污染。 3 方法 3.1 标本采集 所有患者均于清晨空腹采集肘静脉血1.8ml，129mmol/l枸橼酸钠9:1抗凝，3000r/min离心10分钟，分离血清，分装于EP管中，置一80冰箱冻存；在征得患者同意后，其中40例急性白血病患者做了预防性鞘内注射，在鞘内注射前用无菌试管留取脑脊液标本3ml，用5000r/min，离心20分钟，分离上清，同样分装于EP管中，置- 80冰箱保存待测。 标本收集完毕后，所有血、脑脊液标本在试验前取出一次融解，避免反复冻融。 3.2 SDF-1测定 3.2.1 实验原理 本实验采用双抗体夹心ABC-ELISE法。用人TF单抗包被于酶标板上，标准品和样品

7、中的SDF-1与单抗结合，加入生物素化的抗人SDF-1，形成免疫复合物连接在板上，辣急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 6过氧化根标记的streptavidin与生物素结合，加入酶底物工作液，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色加深，在450nm出测OD值，SDF-1浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的SDF-1浓度。 3.2.2 实验前准备 1）提前6小时从冰箱中取出试剂盒、标本，以平衡至室温。 2）稀释标本 每份待测血清和脑脊液标本均取10ul，加标本稀释液190ul，稀释20倍。 3）配置标准品 取1瓶标准品，加入0.3ml蒸馏水，配成4000pg/ml溶液

8、。设标准孔8管，每管中各加入标本稀释液200ul。第一管加标准品200ul，混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释至第七管，最后，从第七管中吸出10ul弃去，使之体积均为200ul。第八管为空白对照。 4）配置洗涤液 用重蒸水1：20稀释。 3.2.3 实验步骤 （1）建立标准曲线:设标准孔8孔，除空白孔外，每孔中加入不同浓度的标准品100ul。 （2）加样:待测品孔每孔各加入待测样品各100ul。 （3）将反应板充分混匀，用封板胶纸封住反应孔，置37孵育箱，120min。 （4）洗板:甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350微升，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干;洗板5

9、次。 （5）每孔中 加入第一抗体工作液100ul。 （6）将反应板充分混匀，用封板胶纸封住反应孔，置37孵育箱，60min。 （7）洗板: 甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350微升，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干；洗板5次。 （8）每孔加酶标抗体工作液100ul （9）将反应板充分混匀，用封板胶纸封住反应孔，置37孵育箱，30min。 （10）洗板: 甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350微升，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干；洗板6次。 （11）每孔加入底物工作液100ul，置37暗处反应15min。 （12）每孔加入100ul滴终止液混匀。 （13）混匀后在450nm处测量吸光度值

10、(5min内)。 3.2.4 结果计算与判断 A所有OD值均减除空白值后再行计算。 B以标准品 2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在Elisa软件上绘出标准曲线。（附标准曲线） 急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 7C. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应SDF-1含量。 4.其他观测指标 骨髓中幼稚细胞数、外周血白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白含量(Hb)及心肌酶（LDH、-羟丁酸脱氢酶）。 5统计学处理 数据统计采用SPSS14.0统计软件，实验数据均采用均

11、数士标准差（ XS）表示，各白血病组之间及其与对照组间血清、 脑脊液SDF-1水平比较采用方差分析或T检验， 两组间计量资料比较，若方差齐，采用t检验，若方差不齐用t 检验； 血清、脑脊液SDF-1值与实验室指标的相关性分析采用直线相关分析，P0.05。 表表 3 CNSL 患者血清患者血清 SDF-1 水平比较水平比较 4. CNSL 患者与对照组脑脊液 SDF-1 水平比较 CNSL组和非CNSL组脑脊液SDF-1水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.01）， CNSL组脑脊液SDF-1水平高于非CNSL组，差异也具有统计学意义（ P0.05）。 表表 4 CNSL 患者脑脊液患者

12、脑脊液 SDF-1 水平比较水平比较 *与正常组比较P0.01，与非CNSL组比较P0.05 0100020003000400050006000CNSL组非CNSL组正常组血清SDF-1 脑脊液SDF-1图2. 图2. CNSL患者与对照组血清、脑脊液SDF-1水平的比较 患者与对照组血清、脑脊液SDF-1水平的比较 组别组别 n SDF-1(pg/ml) CNSL 非CNSL 正常 4 36 20 3700.05438.25 3132.502158.58 2339.85672.25 组别组别 n SDF-1(pg/ml) CNSL 非CNSL 正常 4 36 20 5236.30750.12

13、* 3642.661634.53 1978.53857.99 急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 105. AML 不同分型患者之间血清 SDF-1 水平比较 急性髓细胞白血病患者 M4+M5 组的血清 SDF-1 水平明显高于 M3 组和 M1+M2组，且差异有统计学意义（P0.01），其余各组血清 SDF-1 水平低于正常组，差异无统计学意义。 表表 5 AML 不同分型患者之间患者血清不同分型患者之间患者血清 SDF-1 水平比较水平比较 *与其他组比较 P0.01 6. AML 不同分型患者之间脑脊液 SDF-1 水平比较 急性髓细胞白血病患者各组脑脊液 SDF

14、-1 水平均高于正常组， 其中 M4+M5 组与正常组差异有统计学意义（P0.05），其余各组与正常组之间差异无统计学意义。急性髓细胞白血病 M4+M5 组 SDF-1 水平高于急性髓细胞白血病其他组，差异无统计学意义。 表表 6 AML 不同分型患者之间患者脑脊液不同分型患者之间患者脑脊液 SDF-1 水平比较水平比较 *与正常组比较 P0.05 05001000150020002500300035004000M4、M5组M3组M1、M2组 正常血清SDF-1 脑脊液SDF-1图 3.图 3. AML 不同分型患者血清、脑脊液 SDF-1 水平的比较不同分型患者血清、脑脊液 SDF-1 水平

15、的比较 组别组别 n SDF-1(pg/ml) M4、M5组 M3 组 M1+M2组 正常 4 5 17 20 3596.55750.44 1833.52592.41 2285.05783.07 2339.85672.25 组别组别 n SDF-1(pg/ml) M4、M5组 M3 组 M1+M2组 正常 4 3 14 20 3366.951424.42 * 2921.93472.26 3062.371583.48 1978.53857.99 急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子 SDF-1 测定及意义 117. 急性白血病患者血清、脑脊液 SDF-1 之间相关性 对 40 例急性白血病患者血清

16、、脑脊液 SDF-1 水平作相关性分析，表明血清、脑脊液SDF-1 之间无明显相关（r =0.30，P=0.059） 。 8. 血清、脑脊液 SDF-1 水平与临床相关指标的关系 急性白血病患者血清、脑脊液SDF-1水平与患者年龄、外周血白细胞数、心肌酶（LDH、-羟丁酸脱氢酶） 、骨髓幼稚细胞数之间均无相关。 （见表7） 表表 7 血清、脑脊液血清、脑脊液 SDF-1 水平与临床相关临床指标的关系水平与临床相关临床指标的关系 血清血清SDF-1 脑脊液脑脊液SDF-1 临床指标临床指标 均数标准差均数标准差 相关系数（相关系数（r） p值值 相关系数（相关系数（r） p值值 年龄 外周血白细胞数 LDH -羟丁酸脱氢酶 骨髓幼稚细胞数 50.5517.9（岁） 55.6499.4 (*109/