游离脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞糖代谢影响的研究

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1、石河子大学硕士学位论文游离脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞糖代谢影响的研究姓名：陆环申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：谢建新20100501I摘 要 研究目的：摘 要 研究目的：通过培养 3T3-L1 前脂肪细胞，并诱导其分化至成熟，研究游离脂肪酸（FFA）对脂肪细胞糖代谢的影响。 通过检测 3T3-L1 前脂肪细胞分化成熟过程中， 细胞内活性氧 （ROS）浓度的变化，反应细胞内自由基的变化。 研究方法：研究方法：培养 3T3-L1 前脂肪细胞，通过 IBMX、胰岛素、地塞米松的联合诱导，细胞由梭形转变为大而圆、充满脂滴的脂肪细胞，表明细胞分化成熟。用油红 O 染色鉴定并比较其

2、形态结构的变化。通过不同的 FFA（LPS、EPA、SA、PA）干预成熟脂肪细胞，用 MTT 法检测细胞不同游离脂肪酸刺激细胞 48 小时后，脂肪细胞的存活率。同时，用含 FFA（LPS、EPA、SA、PA）的 DMEM 干预成熟脂肪细胞 6h、12h、24h、48h 时收集培养基，葡萄糖氧化酶法算出各组脂肪细胞的葡萄糖消耗量。 检测诱导不同时间脂肪细胞内活性氧浓度的变化。 对成熟的脂肪细胞，通过 Western blot 检测不同时间各组 FFA 干预后细胞 AMPK、GLUT4 蛋白含量。 研究结果：研究结果： 诱导分化前的 3T3-L1 前脂肪细胞，呈梭形，胞浆中无脂滴，表现为成纤维细胞

3、样的形态，细胞生长至接触抑制后，处于生长停滞期；诱导分化第 2 天，细胞形态变圆，但胞浆中无明显脂滴出现；诱导分化第 4 天，细胞变大变圆，胞浆中有少量脂滴出现在细胞核周围，油红O 染色鉴定可以观察到脂肪细胞胞浆中的脂滴染成红色；第 6 天时，脂肪细胞进一步变大变圆，小脂滴明显增多，聚集在细胞核周围，开始出现“戒环”样结构；诱导分化第 8 天，90%以上细胞均分化成熟，更多的脂滴聚集，部分小脂滴相互融合，形成大的脂滴。 含 LPS、EPA、SA、PA 的培养基作用于成熟脂肪细胞，随着时间的延长，显著抑制脂肪细胞对葡萄糖的吸收（P24 根/天（412 人）戒烟者以前吸烟 1-24 根/天（222

4、8 人）重度吸烟者24 根/天 （5040 人）适度吸烟者 1-24 根/天 （14165 人）偶尔吸烟者（611 人）不吸烟者（31632 人）游离脂肪酸对 3T3-L1 脂肪细胞糖代谢影响的研究 32在美国的青少年中，初次吸烟者多数是肥胖的女性、尝试减轻体重的人或认为自己缺乏个性的女性。 想减轻体重或常考虑体重问题的女学生比不想减轻体重或不考虑体重问题的女学生尝试吸烟的比率高 2 倍【15】。除此之外，控制体重的愿望是许多青少年开始吸烟的初衷。这些研究结果表明，吸烟起始反应或许可以不分性别地触发体重相关机制以减轻体重。 1.2 过量吸烟者与轻度吸烟者的体重过量吸烟者与轻度吸烟者的体重 根据

5、吸烟对代谢的影响可以认为，吸烟数量越多，吸烟者的体重越低。然而，研究表明，过度吸烟者与肥胖有高度相关性【3，4，16】。在癌症预防研究中【16】，吸烟者比从未吸烟者或以前吸烟的人有较低的体重，过度吸烟者（=2 包香烟/天）比其他吸烟者体重高。在男性美国人中对年龄进行标准化后发现，不吸烟者的BMI为25.3，而轻度吸烟者（40根香烟/天）的BMI分别为 24.7、24.7和26.2 。德国一个广泛的成人群体抽样中得出，过度吸烟的男性比轻度吸烟的男性肥胖的居多【3】。 最近瑞士较广泛的一个成人调查显示日益增多的烟民趋向于肥胖【4】。所有的研究都显示，吸烟与体重呈正相关，过度吸烟者比轻度吸烟者更容易

6、超重或肥胖。这些结果已被大家所公认。 为什么过度吸烟者比轻度吸烟者或不吸烟者更容易超重，这个问题至今仍不清楚。一种解释是过度吸烟者比轻度吸烟者或不吸烟者有更多易于增加体重的行为，例如：较少的体力活动、不健康的饮食习惯（摄入的水果和蔬菜较少） 、长期饮酒、极少有体力活动和过高尼古丁的摄取【17】。这些不健康的行为习惯与香烟的消费水平密切相关【18】。 此外，可能还有其它的影响因素。首先，在女性，吸烟的起始效应引起超重尤为明显【15】，吸烟是超重的触发器。而吸烟者长期的代谢和行为变化可能影响到每天的吸烟数量的猜测还缺乏长期的观察研究以排除代谢和长期吸烟养成的习惯的干扰【19】。过度吸烟者体重增加明

7、显，由于各种原因，过度吸烟者比轻度吸烟者多经历了反复的戒烟，处于体重不断减少和增加的危险循环中，又称为“体重循环” ，这种循环与超重或肥胖密切相关【20】。这对于未来研究吸烟和体重的改变的相关因素是必要的。 1.3 戒烟后体重的变化戒烟后体重的变化 许多研究表明，戒烟后更容易增加体重，这一点同样被Ward 2和Filozof 等人19证实。吸烟者会由于怕增加体重而放弃吸烟，另外，体重增加有复发的危险，尤其是对有习惯性饮食的体重正常或体重偏轻的人【21】。 戒烟后体重增加非常普遍。把当前的体重与10年前记录下的体重相比较，戒烟者比连续不间断的吸烟者体重增加了4.4 kg（男性）和5.0 kg（女

8、性）【22】。在对美籍成人10年的跟踪调查中发现，由于戒烟而导致的平均体重增加为2.8 kg（男性）和3.8 kg（女性） 。戒烟导致体重增加达13 kg的发生率为9.8%（男性）和13.4%（女性） 。然而，大多数戒烟者的体重增加=15根/天是体重增加的主要危险因素。过度吸烟者比轻度吸烟者戒烟后的体重增加要多,比戒烟多年的人体重增加的少些, 这与吸烟者的社会经济状况相反【22】。 游离脂肪酸对 3T3-L1 脂肪细胞糖代谢影响的研究 33在美国二十世纪80年代，超重患病率每年增加17%-25%曾经归因于戒烟。然而，一项澳大利亚的研究发现，肥胖患病率增加和吸烟率的降低没有关系【23】。最近，美

9、国的研究表明，吸烟对日益升高的肥胖患病率的影响是微不足道的【24】。 戒烟后会造成体重增加的机制目前仍不清楚【2】。戒烟后体重增加或许由于增加了能量摄入和减少了EE。研究表明，戒烟后，能量的摄入会在短期内增加250 300 kcal/d并且可能会持续相当长一段时间【2】。然而，有些报道指出戒烟后短期内热量摄取没有改变【25】。戒烟后长期的变化很少有令人信服的资料。女性戒烟后出现的能量摄入增加发生在6个月后【26】，这与戒烟后早期发生的体重增加相一致【2】。戒烟后不发生体力活动的下降，脂肪氧化作用和脂肪组织代谢的改变或许也与戒烟后体重的增加有关【27】。此外， 与食物摄取和能量消耗有关的神经肽

10、（如脂连素、 神经肽Y、 食欲素） 和单胺 （如去甲肾上腺素、多巴胺）或许也与之相关【19】。 “调定点”的假说可以帮助我们理解为何戒烟者会增加体重。这个假说认为只要体重低于或高于这个既定的调定点（每个人的调定点有个体差异） ，这种改变就会引起进食行为或EE【28】。尼古丁（或许是其它的吸烟产物）可以使这个调定点降低。因此，戒烟后，戒烟者调定点上调，导致体重增加。 Twardella等人在对4270人的研究中发现，超重的男性吸烟者比正常体重的男性吸烟者更想戒烟，而正常体重的女性吸烟者比BMI较低的女性吸烟者更想戒烟【29】，瘦弱的女性害怕戒烟后体重的增加，而患有疾病的吸烟者常会选择戒烟【31】

11、。但是，最近一项调查显示人们对体重的关心并不会促使其戒烟【44】。不关心体重的人戒烟都很失败，一般关心体重的人，戒烟都会成功。这些结果表明，成功的戒烟者一般体重较高并且不担心戒烟后体重的增加，这或许可以解释部分戒烟者比继续吸烟的人体重增加多的原因。 2 吸烟与脂肪分布、胰岛素抵抗、代谢综合症以及吸烟与脂肪分布、胰岛素抵抗、代谢综合症以及2型糖尿病型糖尿病 对吸烟如何影响体重还有些未知因素， 但越来越多的证据显示吸烟可以积累大量内脏的脂肪，造成胰岛素抵抗，增加了患代谢综合症和2型糖尿病的危险。 2.1 吸烟与腰围吸烟与腰围 腰围或腰臀比 （waist-to-hip ratio， WHR） 是内脏

12、脂肪组织 （visceral adipose tissue ，VAT）的一个显示器。大量的VAT与代谢综合症、糖尿病以及心血管疾病相关【32】。有研究表明吸烟者的WHR 比不吸烟者高，WHR 与吸烟的数量和时间呈正相关，并且WHR与吸烟的数量有剂量反应关系【33】。曾经吸烟的人，从戒烟后WHR就与时间呈负相关而吸烟者相对于不吸烟者有较大的腰围和较小的臀围【33】，因此会出现腹部脂肪的堆积，臀部只有较少的肌肉。高WHR和低BMI的结合，一些专家把它称为“颠倒现象”【34】，相对于不吸烟者， “颠倒现象”在吸烟者常见。 2.2 吸烟者较大腰围发生的可能机制吸烟者较大腰围发生的可能机制 腰围与VAT

13、的积聚密切相关【32】，而VAT受氢化可的松浓度的影响。吸烟者比不吸烟者含有较高浓度的血浆可的松，吸烟会刺激交感神经系统兴奋，引起氢化可的松浓游离脂肪酸对 3T3-L1 脂肪细胞糖代谢影响的研究 34度升高。另外，性激素也与之相关【35】，女性绝经期后雌激素浓度下降，睾丸酮浓度升高，VAT 的积聚随之增加。因此，女性缺乏雌激素且雄激素过剩时会造成VAT的蓄积。女性吸烟者相对于不吸烟者在雌激素浓度上没有变化但雄激素浓度升高，雌激素的生物学效应降低。目前的资料对吸烟可能会影响睾丸酮的浓度还有些相互矛盾。在男性，当睾丸酮的浓度下降时，VAT增加，若在中年男性中给予睾丸酮，会因为脂解作用增加而减少VA

14、T。吸烟也可能会减少男性睾丸酮的浓度。在雄性的狗身上发现，吸烟使得大量血清睾丸酮的浓度下降【36】。总之，这些结果表明，除了过剩的氢化可的松，女性雄性激素和雌性激素的分泌失调， 男性睾丸酮的下降可能在吸烟对VAT的影响中有重要的作用。 2.3 吸烟和胰岛素抵抗吸烟和胰岛素抵抗 胰岛素抵抗、代谢综合症和葡萄糖耐受不良都被认为是机体功能紊乱，相互间有一定的关系【37】。吸烟可能直接增加了胰岛素抵抗（图3） 。吸烟造成的胰岛素抵抗增多且呈剂量依赖性。健康的男性，长期吸烟即使没有其它因素影响胰岛素敏感度，也会造成血浆胰岛素浓度的升高。另外，长期摄入尼古丁会引起高胰岛素血症和胰岛素抵抗【38】。不肥胖的

15、男性，戒烟后8周胰岛素敏感度会得到改善，尽管体重会增加【39】。此外，吸烟者还有胰岛素抵抗综合症的特征， 包括高密度脂蛋白胆固醇降低、 血清三酰基甘油升高、极低密度脂蛋白升高、葡萄糖升高、纤溶酶原激活物抑制剂增加和微白蛋白尿【39，40】。 吸烟 体力活动少 不健康饮食 急性 慢性 胰岛素抵抗 内脏脂肪堆积 代谢综合症 、2型糖尿病 图3 吸烟、胰岛素抵抗、内脏脂肪堆积、代谢综合症和2型糖尿病的关系 代谢综合症认为与吸烟有关。研究表明，男性吸烟者患代谢综合症的比率比不吸烟者高【39】。在对美国1219岁青少年的调查发现，代谢综合症患病率随着对烟草的接触程度而增高： 没有接触到环境性吸烟 （en

16、vironmental tobacco smoke ， ETS） 患病率为1.2%，暴露于ETS的患病率为5.4%，吸烟者的患病率为8.7%【41】。在对年轻人发生冠状动脉危险性的前瞻性研究中发现【6】，15岁没有接触到ETS的不吸烟者葡萄糖耐受不良的患病率为11.5% ，戒烟者为14.4% ，暴露于ETS的不吸烟者为17.2%，吸烟者为21.8%。调节WHR对提高吸烟者葡萄糖耐受不良的发生率和缓和吸烟对内脏脂肪造成的堆积没有影响。 游离脂肪酸对 3T3-L1 脂肪细胞糖代谢影响的研究 35不是所有的研究都认为吸烟与葡萄糖代谢紊乱呈正相关。一项大型的研究，通过改良的葡萄糖耐量试验得出吸烟与胰岛素抵抗不相关【42】。另外，一项对年轻人4 6年的前瞻性研究显示，与逐渐增加的烟草消费伴随的是血压、高密度脂蛋白胆固醇、体重和WHR的降低，高密度脂蛋白的总比率在升高，因此，发生代谢综合症的危险性降低了。减少烟草的消费会得出相