《鱼类抗菌肽基因的克隆与表达研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鱼类抗菌肽基因的克隆与表达研究（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Ab s t r a c tA B S T R A C TT h e o u t b r e a k o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s h a v e c a u s e d h u g e l o s s e s in f i s h c u l t u rei n d u s t ry . T h e p r o d u c t i o n o f a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s h a s b e e n i d e n t i f i e d a s a m a j o rd e f e
2、n s e m e c h a n i s m a g a i n s t i n f e c t i o n s . A n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s a r e a c l as s o f s m a l l ,p o s i t i v e l y c h a r g e d p e p t i d e s k n o w n f o r t h e i r b r o a d - s p e c t r u m a n t i m i c r o b ia l p e p t id ea c t i v it y . G e n e
3、- e n c o d e d ,r i b o s o m a l l y s y n t h e s i z e d a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s a re w i d e l yd i s t r i b u t e d i n n a t u r e ,b e i n g p r o d u c e d b y i n s e c t s , a q u a t i c s , a m p h i b i a n s , b i r d s ,m a m m a l s , p l a n t s a n d m i c r o o
4、 r g a n i s m s .We d i v i d e d t h e p e n g z e c r u c i a n c a r p i n t o t w o g r o u p s : t h e i n f e c t e d g r o u p a n d t h en o n - i n f e c t e dg r o u p .i D e1 D l e c l e o g r即Af t e r c u l t u r e d f o r 2 4 h weT h e in f e c t e dgr o u p h a s b e e n i n f e c t e
5、 d b y i n j e c t i n gAe r o mo n a s句 ,d r o p h i l ae x t r a c t t h e t o t a l R N A o f t h e t w o g r o u p sr e s p e c t i v e l y . T h e o r t h o g o n a l e x p e r i me n t w as u s e d t o o p t i mi z e d t h e P C R r e a c t i o nc o n d i t io n s , a n d t h e n s e l e c t t
6、 h e s p e c i f i c b a n d s t h a t o n l y e x p r e s s e d i n t h e i n f e c t e dg r o u p u t i l i z i n g t h e m R N A d i ff e r e n t i a l d i s p l a y m e t h o d w i t h t h e o p t i m i z e d P C Rr e a c t i o n c o n d it i o n s . T h e s e l e c t e d b a n d s m a k e i t a
7、 v a i l a b l e f o r t h e u p c o m i n g r e c o v e ry ,p u r i f i c a t i o n , re c o m b i n a t i o n , t r a n s f o r m a t i o n , s e q u e n c i n g p r o c e d u r e sI n a w o 喊t h e s p e c i fi c b a n d s t h a t s e l e c t e d b y D D R T P C R m a y b e t h e p o t e n t i a l
8、c o d i n g g e n e o f a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e s t h a t c a n b e u s e d t o c u r e a n d d e f e n s e b a c t e r i a lin f e c t i o n . W e c a n u s e g e n e t i c e n g i n e e r i n g m e t h o d t o c o n s t r u c t e n g i n e e r i n g b a c t e r i ao f a n t i m i c
9、 r o b i a l p e p t id e a n d p r o d u c e a n e w t y p e o f p e p t i d e a n t i m i c r o b i a l m e d i c i n es u b s t i t u t in g f o r a n t i b i o t i c s .K e y Wo r d s : p e n g z e c r u c i a n c a r p ; a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e ; m R N A d i ff e r e n t i a l d
10、 i s p l a y ;g e n e t i c e n g i n e e r i n gt o学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他 人已 经 发 表 或 撰 写 过的 研究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 鱼 A生一 或 其 他教 育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同 志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学 位 论 文 作 者 签 名 ( 手 写 )浏 o“ 4 签 字 日 期 : 坷 年 *月
11、、:学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使 用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅 和借阅。 本人 授权南昌大学可以 将学位论文的全 部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)践叮. 士日 7讨学 位 论 文 作 者 签 名 ( 手 写 ) : 沟 e a签 字 日 期 : 河 年。 月声 日导师签名 ( 手写) :签 字日 期: 洲 叼 年 各 月学位论文作者毕业后去向:工作单位:通讯地址 :电话:邮编 :第 1 章 绪论第
12、 1 章 绪论1 . 1抗菌肚及其研究现状抗 菌肤 ( a n t i b a c t e r i a l p e p t i d e ) 最初是从免 疫后的昆 虫血淋巴 细胞中 发 现的 一类活性多肤。1 9 7 2 年，瑞典科学家B o ma n 将蜡状芽抱杆菌 ( B a c i l l u s c e r e u s ) 诱导 惜古比 天蚕( H y l o p h o r a c e c r o p i a ) 产生 一 种新的肤类物质， 命名为 天蚕 素( c e c r o p i n s ) ， 这是第 一个被发 现的 抗菌 肚. 此后， 人们又在细菌、 真菌、 两 栖 类、喃
13、乳动物和人类中相继发现并分离得到了抗菌肤。迄今为止，己经在自 然 界中找到了 8 8 0种抗菌肤。部分收录在意大利 T r i e s t e大学的抗菌肚数据库( w w w . b b c m. u n i v .t r i e s t e . i t/ - -t o s s i / a n t i mi c . h t mi ) o抗菌肤具有分子量小， 热稳定， 水溶性好， 无免疫原性， 抗菌谱广等特点。 现 在， 它被认为是从细菌到高等哺乳动物普遍存在的一类防御性多肤， 称之为“ 第 二防御体系”. 抗菌肚不仅抗菌谱广， 而且可以抑杀某些真菌、病毒及原虫， 并 对多种癌细胞及动物实体瘤有
14、明显的杀伤作用， 而不破坏正常细胞。近年来， 对 昆虫抗菌物质的研究， 特别是对昆虫抗菌肚的研究已成为一个迅速发展的新领域， 越来越引起人们的关注和重视。抗菌肤可望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。但天然抗菌肚的来源 少， 成本高， 无法满足临床试用和基础研究的需要。因此通过D N A 重组技术来获 得大量抗菌肤， 成为人们普遍关注的焦点。同时， 对抗菌肤抗菌、抗肿瘤机理的 深入研究也越来越具有重大的理论意义和实际应用价值， 前景十分广阔。1 . 2抗菌肚的基因工程研究1 . 2 . 1天然杭菌肚基因的克隆与表达利 用差异 显示 技术 ( d i ff e r e n t i a l d i
15、 s p l a y D D ) ， 对诱导和未诱导的 蚕、 蝇 等 基 因的差异表达进行研究， 可得到一些新的抗菌肚类相关基因， 是关于基因分离、 表 达研究的较新方法。 S a n g H y u n K im等用 载体试剂盒 U n i - Z A P X I 构 建了 E . c o li 感 染的 家 蚕 ( B o m b y x m o r i ) 幼 虫c D N A 文 库， 以。 3 2 p A T P 标记 ， 选 出 感 染的与未感染的B o m b y x m o r i 差异D N A克隆， 在基因文库用? ,D A S H试剂 盒筛 选出阳 性克隆， 酶切， 测序
16、， 得到E n b o c i n ( 新一种抗菌肤) 基因序列，差异筛 选第 1 章 绪论了抗菌肤基因E n b o c i n o 据此设计引物从昆虫细胞m R N A进行R T - P C R扩增. 扩 增片 段克隆 进p G e m T P C R克隆 载体， 此载体再 插入 到杆 状病毒p B a c P A K 9 ( 含 强启 动子) ，以 转移的重组 质粒 和野生型B a c P A K病毒D N A一 起通过脂 质 体转 移法共转化进 S t 2 1 细胞经在胞内同源重组得到杆状病毒 v A c . E n b o c i n H I ，此 病毒含E n b o c i n 基因， 经分析其 约为1 . 2 k b ， 含一6 6 0 b p 内 含子， 此基因 在S f 2 I 细胞中表达，用 N o rt h e rn - b l o t ， 尿素一 S D S磷酸化聚丙烯酸W 胶电泳( P A G E ) 可 证实并检测到E n b o c i n 的表 达。 K a n g -D等对T r i c h o p lu s i a n i 进
