《RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖的影响（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学硕士学位论文RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘 附、增殖的影响姓名：马亮申请学位级别：硕士专业：外科学（骨外）指导教师：王洪20080401独创性声明独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有
2、关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1RGD序列肽修饰的丝素蛋白仿生支架材料 对骨髓间充质干细胞粘附、增殖的影响 RGD序列肽修饰的丝
3、素蛋白仿生支架材料 对骨髓间充质干细胞粘附、增殖的影响 硕士研究生 马 亮 导 师 王 洪 副教授 摘摘 要要 目的：目的：为了更有效的促进种子细胞在韧带组织工程支架材料上的粘附增殖和从而合成和分泌细胞外基质，本实验在丝素(silk) 薄膜上共价接枝人工合成的具有生物活性的 GRGDS 序列, 然后在其表面种植体外培养的骨髓间充质干细胞， 探索 RGD 多肽修饰的丝素蛋白支架材料对骨髓间充质干细胞的粘附、增殖的影响。 方法方法：首先制备丝素蛋白薄膜材料，用交联剂 EDC 及 NHS 将 RGD 多肽共价接枝于丝素蛋白支架材料表面，X 射线光电子能谱检测分析材料表面 C、N、O 元素分布及含量，
4、评价接支修饰情况。以未接多肽的丝素蛋白材料和细胞培养板分别作阴性对照和阳性对照。 取第三代 MSC 接种到材料和培养板上，在培养 4h、12h 后沉淀法定量检测粘附的细胞数检测细胞粘附率, 培养 1d、2d、3d、4d 后比较材料上的细胞标准化细胞密度来反映细胞的增殖程度，培养 24h 后倒置相差显微镜下观察细胞粘附形态及铺展情况，对细胞骨架作免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察两组细胞骨架的组织情况。 结果结果: XPS 检测表明修饰前后材料表面 C、N、O 元素分布及含量明显不同。培养4h、12h 时两时间点实验组细胞粘附率均显著高于阴性对照组,但与阳性对照组无明显差异，培养 1d、2d
5、、3d、4d 时各组细胞的增殖程度无显著性差异; 24h 时倒置相差显微镜下观察实验组细胞粘附形态及铺展情况较阴性对照组好， 将两组细胞作免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下观察发现实验组细胞的粘附数量，质量和细胞骨架的组织情况都较阴性对照组为好。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2结论结论: 用交联剂 EDC 及 NHS 可成功将 RGD 多肽共价接枝于丝素蛋白支架材料表面。RGD 多肽修饰对细胞增殖无明显促进作用,但能显著提高丝素蛋白支架材料对骨髓基质干细胞的粘附性，促进其在材料上的粘附和细胞骨架的组织。 关键词 关键词 韧带组织
6、工程 仿生材料 表面修饰 RGD 丝生物材料 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3Modulation of adhesion and proliferation of mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterial modified with RGD peptide Medical master Ma Liang Tutor Prof. Wang Hong Abstract Object: In order to promote the seed cells prolifera
7、tion, adhesion on the tendon tissue engineering scaffold and to promote the synthesis and the secretion of the extracellular matrix. So the silk matrix modified with RGD peptide was prepared, the proliferation and adhesion of MSC on the modified scaffold was investigated. Methods: The GRGDS sequence
8、 was covalent on the surface of silk material by the cross linking agent (EDC: NHS) and detected the contents of the Carbon、Nitrogen and Oxygen element by the X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The third generation of mesenchymal stem cells (MSC) was seeded onto the RGD modified silk film, the
9、silk film and the tissue culture plate, and incubated for 4h and 12h at standard condition, in each experiment the number of adhesive cells was counted to evaluate the efficiency of cell adhesion, incubated for 1d, 2d, 3d and 4d, the cell density was calculated and was used as index of cell prolifer
10、ation. MSC was seeded onto the RGD modified silk film and the silk film, using the inverted phase contrast microscope to observe the cells adherent appearance and cells spreading morphous, using the immunofluorescene technique labeling the cell skeleton after 24h, and observed using the Laser Confoc
11、al Microscopy. Results: The XPS detection showed that the contents of the Carbon、Nitrogen and Oxygen element were significant different in the surface between the modified and the non-modified. We found after 4h and 12h culture the efficiency of cell adhesion in the modified silk scaffold was higher
12、 than the unmodified silk scaffold, no significant difference between the modified silk scaffold and the tissue culture plate .No significant 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4difference in cell density in each group for culture of 1d, 2d, 3d and 4d. After 24h culture the cells adheren
13、t appearance and cells spreading morphous on the modified silk film were better than the unmodified. Observing undering the Laser Confocal Microscopy the quality and the quantity of cell adhesion on the modified silk film were better than the unmodified and their cytoskeleton was more robust. Conclu
14、sion: The GRGDS sequence can be covalent on the surface of silk material by the cross linking agent (EDC: NHS) successfully. RGD peptide enhanced cell adhesion to silk scaffold, but no obvious effects were observed in cell proliferation. Keywords: tendon tissue engineering ， biomimetic material ， su
15、rface modification， RGD， silk biomaterial 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5前前 言言 交叉韧带 (cruciate ligament)是膝关节重要的关节内韧带， 对膝关节正常的运动和稳定起非常重要的作用。 交叉韧带损伤后自体修复能力差， 往往需进行韧带重建手术。目前临床上常使用的移植物有自体移植物、异体移植物和人工合成材料。使用自体移植物存在来源限制、供区疼痛等并发症问题；异体移植物有潜在的传播疾病和免疫排斥反应的危险；而人工合成材料远期疗效尚存在争议，这限制了其在临床中的应用。组织工程技
16、术的发展为交叉韧带重建提供了新的思路和途径，使研究者寻找更为理想的韧带移植物成为可能。 丝纤维材料因其良好的生物力学性能故最早用于构建组织工程韧带研究中。丝纤维是一种由多种物种分泌的天然共聚物，最常见的为蚕丝和蛛丝。丝纤维材料具有轻比重（1.3g/cm3） 、高强度（4.8Gpa）和良好的粘弹性,机械性能非常优秀。而且丝纤维具有良好的热稳定性，可耐受很宽范围温度的处理过程1。实验证明，蚕丝纤维具有良好的生物相容性 、优良的力学性能和弹性 、可以在体内通过水解而缓慢降解，表面有多种化学基团，易于化学共价修饰粘附位点和细胞因子，可通过遗传工程改造丝蛋白的成分来调节分子量的大小、可结晶性和可溶性，是构建组织工程韧带的较为合适的生物材料2。 特别是材料编织后， 其力学性质， 如极限拉伸强度 (ultimate
