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1、项目名称：血管发育和稳态维持的遗传及表观遗传机制首席科学家：杨晓 中国人民解放军军事医学科学院起止年限：2012.1 至 2016.8 依托部门：总后勤部卫生部一、关键科学问题及研究内容关键科学问题脊椎动物的血管发生和血管形成是一个高度保守的涉及多种细胞特化和定向分化以及相互作用的复杂过程。 血管内皮细胞如何通过遗传和表观遗传机制对细胞内外的调控信号做出精确的反应并与相邻的不同类型细胞相互作用，历经血管发生和血管形成逐渐发育成具有精细复杂等级结构的功能性血管网络并保持其稳态；这些调控机制的异常和紊乱又如何导致心脑血管疾病的发生是本项目关注的关键科学问题。具体包括：1、血管发生的遗传和表观遗传机
2、制：血管系统形态建成的分子机制；表观遗传修饰的改变（重点关注组蛋白的甲基化修饰以及基因组的甲基化修饰）是否可以在血管形成过程中起到调节作用。2、血管内皮细胞特化和定向分化的分子基础：原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理；定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理；冠脉内皮细胞特化的分子机制。3、重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制：TGF-和VEGF 信号通路及其调控的 miRNA 调节内皮细胞功能、 内皮细胞 -壁细胞相互作用、 及其对血管重塑和稳态维持的功能和机制。4、血管损伤后重塑的分子机制：血管损伤及重
3、塑过程中凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用及其机制；牵拉刺激引起内皮细胞炎症分子的释放；血管损伤及重塑过程中血管平滑肌细胞增生的分子机制和干预措施。主要研究内容1、血管发生是血管发育的早期事件，涉及图式形成、内皮细胞命运决定和分化等发育生物学和细胞生物学基本科学问题。本项目拟利用斑马鱼作为模式生物，通过大规模诱变技术筛选血管发生异常的突变体，寻找血管及相关组织器官发育的重要调控因子与标记基因，进而深入研究它们在血管发生过程中的功能。在血管发生的表观遗传学机制方面，通过表达谱测序来得到斑马鱼中特定时期可能存在的甲基化酶或去甲基化酶，克隆得到这些基因，通过体外合成 mRNA 后进行注射以验证这些基因在血
4、管发生过程中的作用。通过构建表达甲基化酶或者去甲基化酶的转基因鱼，结合体外生化实验验证这些甲基化酶或者去甲基化酶在血管形成不同时期的生理功能。此外，通过转基因方法在血管内皮细胞中特异性表达绿色或红色荧光蛋白（GFP 或 RFP） ，结合长时间在体双光子或共聚焦显微镜成像技术，实时记录和跟踪中脑内的所有血管的三维形态变化。进而，运用图像分析、流体力学模型分析、细胞生物学、分子生物学等手段，研究脑血管网络发生和发育的宏观规律和分子机制。2、探讨血管内皮细胞特化和定向分化的分子基础。利用多种特异性标记血管系统的转基因鱼和大规模诱变技术筛选影响血管发生和造血系统的突变体，通过共聚焦显微镜进行实时观察并
5、比较野生型与突变体中血管发生和造血过程的差异，研究血液血管母细胞分化成血管内皮细胞和血细胞的谱系关系及其调控网络。同时，结合内皮细胞特异性基因敲除技术，研究主动脉腹侧内皮细胞定向分化为造血干细胞的分子调控机理。此外，寻找高等哺乳动物小鼠的冠脉内皮细胞起源，利用Cre-LoxP 技术揭示 Notch 信号通路调控冠脉发生以及内皮细胞生物学活性的分子机制，阐明心外膜促进冠脉发生的重要生理功能和机制。3、在重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制研究方面，主要利用基于 Cre-LoxP 系统的小鼠组织特异性条件基因敲除技术，构建血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠，深入
6、研究不同类型心血管细胞如何对来自自身和环境的TGF- 和 VEGF 信号做出精确反应， 以及这种反应性异常如何导致血管重塑异常以及心血管疾病的发生。同时筛选受 TGF- 调控的 miRNA ，并对这些 miRNA 调节内皮细胞功能、 内皮-壁细胞相互作用、及其在血管重塑过程中的功能和机制进行深入的探讨。4、综合利用基因敲除小鼠和多种血管损伤模型，深入研究血管损伤后重塑的分子机制。主要探索血管损伤后平滑肌细胞凋亡的关键信号通路IGF-1R-SGK1的作用、研究介导血管损伤后凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用的关键分子机制、阐明血管损伤及重构过程中炎症细胞的来源、阐明阻断COX-2 来源的前列腺素对血管
7、损伤后内膜增生的保护作用及其分子机制。同时明确深海鱼油 EPA/DHA 是否协同 COX 通路干预血管重塑、深海鱼油 EPA 能否调节动脉损伤后血管重塑、以及深海鱼油EPA 与阿斯匹林协同调节血管损伤后重塑以及抗血栓作用和机制。二、预期目标总体目标：本项目瞄准血管发育研究领域的前沿，整合国内优秀研究团队， 系统深入地开展血管发生和血管形成的遗传和表观遗传机制研究。本项目的总体目标如下：阐明血管发生和血管形成过程中新的遗传和表观遗传机制；揭示血管内皮细胞特化和定向分化的调控机制；明确重要信号通路及其调控因子包括miRNA 调节血管重塑稳态维持的功能和机制；探索血管损伤后重塑的分子机制及其干预措施
8、。通过本项目的实施，建立和完善血管发育研究的新的技术体系，实现在血管发生、血管形成及其稳态维持研究方面的理论创新，建立多种人类心血管疾病的遗传修饰动物模型， 为心脑血管疾病的风险预警、精确诊断、 有效治疗和药物研创提供新思路、新途径和新靶标， 并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队。五年预期目标：1、发现一批新的调控血管发生和血管形成的基因、组蛋白修饰因子或miRNA ，阐明这些调控因子影响血管发育的生理功能和分子机制；研制一批模拟人类心血管疾病的新型遗传修饰动物模型；筛选鉴定一批具有潜在临床应用价值的心血管疾病诊断及治疗的新的分子靶标。2、建立一整套血管发生和血管形成研究的技
9、术平台和技术体系。3、培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50名以上、博士后 12名以上。4、在国际一流杂志（ IF10）发表论文 8篇以上，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文 20篇以上。三、研究方案总体研究思路和项目研究的技术路线及可行性本项目分为四个课题， 将综合利用遗传修饰斑马鱼和小鼠的不同优势，全面系统地研究血管发生和稳态维持的遗传和表观遗传机制，为理解血管发育异常相关疾病的病理和分子机制提供新的线索。前两个课题着重研究血管发生过程中的遗传和表观遗传机制， 课题一侧重于通过高通量测序与诱变筛选影响血管发生的新型调控因子， 而课题二重点研究生血内皮特化和冠脉发育
10、的机制。课题三和课题四分别研究生理性血管重塑和病理性血管重塑的遗传和表观遗传机制，研究不同心血管细胞如何对重要信号做出精确反应及其维持心血管稳态的作用和机制。四个课题分别关注血管发育和稳态维持不同阶段主要的科学问题，四个部分各有侧重，又紧密衔接。课题组间通过合作互相促进。课题一：血管发生和调控的分子机制在血管及相关组织的基因表达调控网络方面，本课题拟首先从前期工作中筛选到的转基因库入手，通过FACS分选结合新一代测序技术得到血管及相关组织的全基因组表达谱。 通过表达谱分析， 辅以文献查阅、 生物信息学分析遴选感兴趣的基因，特别是编码甲基化酶、去甲基化酶的基因。随后，综合运用多种手段获得感兴趣基
11、因的瞬时或稳定的过表达或失活突变体，例如利用体外合成 mRNA或morpholino （MO）进行单细胞胚胎注射瞬时改变基因的表达，构建基于Hsp、Gal4/UAS 等系统的时空特异性转基因鱼系以稳定改变基因的表达，或者通过人工锌指核酸酶（ ZFN）介导的基因打靶获得突变体，同时从已有的突变体库中遴选感兴趣的突变体，通过观察胚胎的表型、（通过整体胚胎原位杂交）检测血管特异性标记基因的表达、 检测胚胎甲基化水平的改变， 在多层次上研究感兴趣的基因及其突变在血管及相关组织器官发育过程中的功能，从中寻找血管及相关组织器官发育的重要调控因子与标记基因，研究这些因子的作用机制及其与其它因子之间的相互作用
12、， 研究甲基化跟血管发育的关系， 为阐明血管及相关组织器官的发育与分子调控机制提供必要的理论与实验基础。在血管网络的形态发生方面，本课题拟构建在血管内皮细胞中特异性表达GFP或RFP的转基因鱼系， 通过双光子或共聚焦显微成像技术， 实时、动态观察并记录中脑血管网络的三维构建过程。同时，结合图像分析、流体力学模型分析，并应用细胞生物学与分子生物学实验技术，探索脑血管网络的发育规律与机制， 及其与脑发育与脑疾病的关系。总体研究方案如下：课题二：血管内皮细胞特化和分化的调控机制本课题将利用转基因斑马鱼遗传学和胚胎发育的优势以及本课题组筛选到的多个影响造血系统和血管生成的突变体，结合已建立的多种特异性
13、标记血管系统的转基因斑马鱼scl -DsRed 和 scl -GFP，通过共聚焦显微镜进行实时观察（live image ）并比较野生型与突变体中造血及血管生成过程的差异，从而阐明在此过程中起重要调控作用的分子网络。同时利用scl 转基因和 scl 基因敲低的斑马鱼来研究 Scl 在淋巴管形成中的作用， 以及它与其他淋巴管形成调节因子的相互作用。课题组还利用转基因小鼠模型来研究冠脉内皮细胞发育过程及其调控的分子机制。主要通过Cre-LoxP 系统的组织特异性条件基因敲除技术，构建冠脉内皮特异性Cre 小鼠，同时利用体内组织特异性转录因子标记技术和免疫共沉淀技术及 ChIP-Seq 技术， 深入
14、研究 Notch 信号通路以及 HIF 转录因子在调控冠脉内皮细胞的增值和分化过程中的分子机制。总体方案如下：课题三：血管内皮细胞及其微环境在血管重塑中的作用和机制本课题将利用基于Cre-LoxP 系统的组织特异性条件基因敲除技术，研制血管内皮细胞、 血管平滑肌细胞、 脑血管内皮细胞特异性TGF- II 型受体、Smads以及 VEGFR2 条件基因敲除小鼠，深入研究血管内皮细胞和平滑肌细胞如何对TGF- 和 VEGF 信号做出精确反应并调节内皮分泌、 血管重塑以及脑血管重塑和稳定性的生理功能和机制。 利用高通量芯片、 酵母双杂交、 免疫共沉淀结合质谱等技术筛选与 TGF- 、雌激素和缺氧诱导
15、因子-1（HIF-1 ）信号通路相互作用的新型血管调控候选因子， 并深入研究这些候选因子对血管生成靶基因的选择性及表达的影响， 探索候选因子调控血管生成的分子机制。此外，利用心血管特异性条件基因敲除小鼠筛选受TGF- 信号调节的miRNA ，并深入研究这些miRNA调节血管内皮细胞或者血管平滑肌细胞功能和稳态维持的作用和机制。总体研究方案如下：课题四：血管损伤以及重塑的分子机制血管平滑肌细胞腔内迁移与增生导致官腔变窄是血管成形术和自体血管移植失败的主要原因， 但其内在分子机制尚不清楚。 本课题将在前期工作的基础上以小鼠静脉移植为研究模型， 以平滑肌细胞凋亡为切入点， 以凋亡平滑肌细胞的炎症放大
16、反应为主轴， 利用小鼠静脉移植模型及体外机械拉力系统，深入研究平滑肌细胞凋亡的分子机制（围绕IGF-1R-SGK1信号转导通路 ） ；进一步利用基因缺陷小鼠静脉移植模型明确凋亡平滑肌细胞炎症放大作用的分子机制（如巨噬细胞激活作用） ,结合特殊转基因工具小鼠的静脉移植模型研究静脉移植过程中炎症细胞的来源及类型； 试图阐明血管损伤后凋亡平滑肌细胞通过放大炎症细胞导致血管损伤后重塑的分子机制。同时，小鼠股动脉损伤（内皮细胞剥脱）为研究模型（模仿动脉成形术） ，以转基因动物为研究工具，围绕膜磷脂代谢通路，深入研究主要炎性介质 （如前列腺素或深海鱼油代谢产物）对动脉损伤后血管重塑的保护作用， 并了解其可能信号通路的分子机制，观察阿司匹林 （前列腺素抑制剂）与鱼油干预对动脉损伤后血管重塑的协同作用。从而最终为血管损伤及重塑研究提供理论依据， 期望优化冠心病、 血管成形术后重塑等现有预防和治疗方案、发现新的抗心血管疾病的靶点。总体研究方案如下：创新点1、利用遗传修饰斑马鱼和小鼠作为模式生物，在动物整体水平上研究血管发育和稳态维持的分子机制。2、综合利用遗传修饰斑马鱼和小鼠的优势，采取正
