《基于PCR扩增技术的病毒DNA电化学传感分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于PCR扩增技术的病毒DNA电化学传感分析（97页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、独 创 性 声 明本人声明: 所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知， 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作过的同志对本研究所作出的任何贡献，均已 在论文中作了明 确的说明并表示了 谢意。签 名 : 1才 永 舔2 0 0 3 年 1 2 月0 2日o0南气 州c 月 户 书 阵d 匕 理 位 宝 仑召 欠中 文 摘 要毕业论文题目:基于P C R扩增技术的病毒D N A电 化学传感分析分析化学 专业指导教师 ( 姓名2 0 0 1 _级
2、博士生 性名:、职称 ):电化学生物传感技术， 因其具有灵敏度高、 价格低廉、自 动化程度高和易微型化等特点， 被认为是一种有发展前景的分析测试方法。 这种方法具有很高的选择性， 能满足复杂样品分析所提出的要求， 同时可以进行在线甚至活体分析。 对于 D N A的电化学行为和识别的研究日 益受到重视，基于核酸杂交过程的 】D N A生物传感器正朝着快速、 廉价地诊断遗传性疾病以及传染病的方向快速发展。1 .乙肝病毒D N A的P C R 扩增设计合成了 一对引 物， 利用P C R 方法扩增已 知序列的短链乙 肝病毒( H B V )D N A片断 ( 1 8 1 碱基对) ，并对P C R
3、扩增产物进行了电 泳以 及紫外检测。2 .以二茂铁为电化学指示剂H B V D N A 杂交传感器的研制利用交联剂将单链 H B V D N A的3 端轻基和自 组装在金电极表面的疏基乙酸 ( T G A )的梭基醋化共价键合，实现了D N A片段在电极表面的固定。 利用电活性指示剂二茂铁六氟磷酸盐( F c P F 6 ) 监测电 极表面的杂交反应。 研究了F c P F 6与固定在疏基乙酸自 组装金电极表面的单链和双链H B V D N A之间的相互作用，根据其不同的电化学响应， 提出了一个具有高灵敏度的无需标记物的杂交生物传感器，建立了监测D N A杂交反应和检测乙肝病毒D N A片断序
4、列的方法。 利用交流阻抗以 及X射线光电子能谱对固定在金电极表面的单链D N A进行了表征。结 合P C R 扩增技术的 这种电 活 性指示剂 可以 灵 敏地检测l 了 拷贝( 大 约1 .7 x 1 0 “2 0m o ll初始模板H B V D N A分子。3 .耐尔蓝和吸附态单双链D N A 作用的电化学研究以及在D N A 杂交传感中的应用0南 京 大 2 * 1 巾 阵d: 学 七 R论 文中 文 坟 要用电化学方法研究了耐尔蓝 ( N B )分别与吸附在金电极上的小牛胸腺s s 和d s D N A的相互作用。 与裸金电极以及有s s D N A吸附的金电极相比， 在吸附d s D
5、 N A的电极上， N B的峰电流显著增大， 它在裸金电极、 s s D N A / A u电极和d s D N A / A u电 极 上的电 子 传递 速 率常 数 分 别为1 .4 1 0 . 1 , 1 .2 士 0 .0 2 和2 .9 士 0 .2 s -1 , L a n g m u i : 吸 附 常 数 分 别为( 2 .2 1 0 .2 ) x 1 0 5 , ( 1 .6 1 0 .2 ) x I O ， 和 ( 4 .2 1 0 .6 ) x 1 0 5 m o l “1 1 。 耐 尔 蓝 通过静电作用与s s D N A结合， 而在与d s D N A作用时， 显示出
6、静电和嵌入两种作用。在p H 7 .4 的T ri s - H C I 溶液中， N B 和d s D N A的 键合常 数为 ( 5 .9 1 0 .2 ) x 1 0 4 m o l - I l ,而在含有 。 . 0 1 m o l 1 “ 1 N a C l 的p H 7 .4的 T ri s - H C I 溶液中，键合常数为 ( 3 .2 士 0 .0 3 ) x 1 0 4 m o l -1 1 。 两 者的 键 合 位 点 数 分 别 为0 .9 士 0 .0 2 和 1 .6 1 0 . 1 . N B在s s D N A / A u 电极和d s D N A / A u 电
7、极上响应电流的不同表明， N B可以作为D N A杂交的电活性指示剂，并成功应用于H B V D N A片断的P C R产物的杂交识别。4 .金属配合物 O s ( b p y ) z C I z + 为指示剂的H B V D N A 杂交传感器研究用共价键合的方法将H B V D N A片段修饰到金电极表面， 发展了H B V D N A传 感器。 以 O s ( b P Y ) 2 C 1 2 作为电 化学 指 示 剂， 研 究了 O S ( b P Y ) 2 C I2 1 + 分 别与 杂 交 前后金电极上的小牛胸腺以 及H B V s s 或d s D N A的相互作用。与裸金电极以
8、 及共价 修饰的s s D N A电 极相比 ， O s ( b P Y ) 2 C 12 + 在杂交后 得到的d s D N A电 极上的 峰电流显著增大。错配对照实验显示，H B V D N A在金电极表面的杂交具有特异性， O S ( b P Y ) 2 C 1 2 + 可以 用作H B V D N A传感器的电 化 学指示剂， 采用该配 合物作电 化学 指示 剂并结合P C R 技 术， 至少能 检测8 . 3 1 。 一m o l 的 初始 模板H B V D N A分子。5 . 多壁碳纳米管修饰丝网印刷电极上单链D N 的电化学行为与检测设计了一种复合型丝网印刷电极， 在工作电极上
9、修饰多壁碳纳米管， 用循环伏安法研究了s s D N A鸟嚓吟残基直接电化学氧化，碳纳米管显示出优异的催化特性。 电极的生产成本相当低廉， 测定样品的时间短。 可以 灵敏地测定富集在修饰电 极表 面的s s D N A ， 检出 限 为2 .0 w g m l - 1 。 同 时 利 用 交 流阻 抗 方 法 表 征了 电 极的表面性质。 成本低廉的电 极以 及快的测定速度使得此核酸传感体系具有较大的商品化潜力。V南 京 大 学 博 士 学 位 于 仑岁 七中 ，二 摘 要奋6 . R N A 在多壁碳纳米管修饰的丝网印刷电极的电化学研究利用多壁碳纳米管修饰丝网印刷碳电极建立了定量测定R N
10、A的方法，通过富 集， 检出 限 为8 .2 R g m l - 。 在 对R N A 上A 残 基 的 电 化 学 氧 化中 ， 碳纳 米 管 显示出优异的催化特性。区别于其它检测R N A的方法，此体系测定步骤简便， 测定结果直观。关键词:D N A生物传感器，杂交生物传感器，丝网印刷电极，多壁碳纳米管DNA金电极R N A ， 二茂铁六氟磷酸盐 ( F c P F 6 ) ， 耐尔兰 ( N B ) , 饿联毗咙 ( O s , b p y ) ,，聚合酶链式反应 ( P C R ) ，循环伏安，示差脉冲伏安，交流阻抗，X射线光电子能谱，扫描电子显微镜 ( S E M ) ，计时安培法0
11、南 京 大 学 俘 士 学 位 论 文英 文 摘 要THES I S:S P E C I A L I Z A T I O N: A n a l y t i c a l C h e m i s t r yP OS T GR ADUA T E . Y o n s - k a nME N T O R : P r o f e s s o r H u a n g - X i a n J uT h e e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e s h a v e b e e n c o n s i d e r e d t o b e p r o m i
12、 s i n g f o rd e t e r m i n a t i o n s b e c a u s e o f t h e a d v a n t a g e s s u c h a s h i g h s e n s i t i v i t y , l o w c o s t , e a s ymi n i a t u r i z a t i o n a n d a u t o ma t i o n . T h e e l e c t r o c h e mi c a l s t u d i e s o n t h e b e h a v i o r s a n dr e c o g
13、 n i t i o n o f D N A h a v e a t t r a c t e d c o n s i d e r a b l e a tt e n t i o n . D N A b i o s e n s o r s b a s e d o nn u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n p r o c e s s a r e r a p id l y b e i n g d e v e l o p e d t o w a r d s t h e g o a l o fr a p i d a n d i n e x p e n
14、 s i v e d i a g n o s i s o f g e n e t i c a n d i n f e c t i o u s d i s e a s e s .1 . P C R a m p l i f i c a t i o n o f H e p a t i t i s B v i r u s D N AP C R m e t h o d w a s e m p l o y e d t o a m p l i f y t h e s e q u e n c e - k n o w n h e p a t it i s B v i r u s ( H B V )D N A f
15、r a g m e n t s u s i n g a p a i r o f d e s i g n e d o l i g o n u c l e o t i d e p r im e r s . P C R p r o d u c t s w e r ev e r i f i e d b y a g a r o s e e l e c t r o p h o re s i s a n d U V s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s .2 . D e v e l o p m e n t o f h e p a t i t i s B
16、v i r u s D N A h y b r i d i z a t i o n b i o s e n s o r u s i n g F c P F 6 a se l e c t r o a c t i v e i n d i c a t o rS t r a t e g y f o r t h e e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n o f H B V D N A fr a g m e n t s w a s d e s i g n e db y c o v a l e n t l y i m m o b i l i z i n g s i n g l e - s t r a n d e d H B V D N A f r a g m e n t s o n g o l d e l e c t r o d es u r f a c e v i a c a r b o x y l a t e e s t e r a s l i n k a g e b e t
