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1、实验三 常用培养基的制备、灭菌与 消毒实验目的：1.了解培养基的配制原理 2.掌握配制培养基的一般方法和步骤培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物 的营养基质原则：目的明确 ;营养协调;控制PH、渗透压等条件;经济节 约方法：查阅文献;精心设计;试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水 一、按成份的不同划分天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态划分固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途划分基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培 养基牛肉膏蛋白胨培养基n牛
2、肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和 最普通的细菌基础培养基。其配方如下：n牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15 20g，水1000mL，PH7.07.2(后调)高氏1号培养基n高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的 合成培养基。其配方如下：n可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g， K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g， FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水 1000mL，pH7.47.6。 查氏合成培养基n查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的 培养基,其配方如下：nNaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g,MgS
3、O4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然麦芽汁培养基n用来培养酵母菌,干麦芽粉加4倍水,在50- 60保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至 糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过 滤，调pH为6.0。消毒与灭菌消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法： 物理的方法：加热、过滤、辐射 化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破 坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗 生素等。 加热法： 干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管 口和瓶口，涂
4、布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160170C）加热灭菌12h ，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与 水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在180；3）物品不能太挤；4）温度降至70时才开箱门。 湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固， 因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿 热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干 热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有 所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌 ，也可用
5、于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项：1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为 “0”时方可打开。 n在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内 冷空气的排除是否完全极为重要，因为空 气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以， 当水蒸气中含有空气时，在同一压力下， 含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温 度的关系见表2常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛 乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采 用间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间1015min，超高温杀菌 135-150C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。优点 ：保持食
6、品价值和营养成分。过滤除菌：原理：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法 。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。注意事项：1、压力适当；2、无菌条件下进行；3、防止渗透现象。 辐射灭菌：原理：紫外线波长在200300nm，具有杀菌作用，以265 -266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生 臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比 。缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。应用：无菌室，医院。注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。化学药品灭菌：原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺
7、类及多数抗生素。注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类 以及微生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含 某一种或某一株微生物的过程。为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不 一定保证是一种菌。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法稀释混合平板法、平板划线法 实验四 微生物的分离、纯化及培 养技术稀释涂布平板法 ：步骤： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏 培养基冷却至55-60时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养 基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。2、制备污
8、水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三 角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中， 以此类推，制成不同稀释度。3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后 用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸 取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28培养箱中培养3- 5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37培养1-2days。5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。 平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实 验日期。 2、划线方法 稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温
9、度 3、混合均匀微生物培养技术1、斜面接种 2、液体培养基接种 3、穿刺接种 将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培 养箱 中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4 冰箱中 保存。观察菌落形态并记录序号 来源 大小 形状 边缘 颜色 表面 代谢物 种类实验五：放线菌及霉菌形态观察目的要求1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。 2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操 作方法。 3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。原理放线菌是一群丝状，G+的细菌，在气生菌 丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pH与细菌 相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。其DNA 碱基组成中GC含量特别高。超过任 何已知的
10、细菌。 许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生 。放线菌(Actinomycetes)分生孢子丝琼脂表 面基内菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium （基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝） with chains of conidiospores（分生孢子）分生孢子丝琼脂表 面基内菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）
11、and aerial mycelium （气 生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）n放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝 分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生 成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直 、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态 。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状 等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴 定的重要依据。 放线菌的菌落早期绒状同 细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落 呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射 状。链霉菌的各种孢子丝结构链霉菌的分离 ： pH中性偏碱 喜干（含水少） 采用含各种无机盐的选择性培养基已知放线菌能够产生500多
12、种抗生素。大多数抗生素对不同的细 菌有独特的疗效有50多种被实际应用Antibiotics放线菌Actinomycetes 霉菌 ( molds)n是丝状真菌的总称,即“发霉的真菌”。通常指菌丝体比 较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下 大量生长繁殖。形态特征（ Morphological characteristics ）n属异养型真核生物，具有丝状或管状结构 ，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状 结构称为菌丝体。n营养菌丝（vegetative mycelium）：汲取营养n气生菌丝（aerial mycelium）n繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。分类（classificati
13、on）n有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细 胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂， 每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之 间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。n无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞 ，菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质 体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。(1)nonseptate(2)septate繁殖方式n无性繁殖：n芽生孢子n节孢子n孢囊孢子n后垣孢子n分生孢子n有性繁殖：n卵孢子n接合孢子n子囊孢子Sporangiospores 孢囊孢子（Sporangiospores are formed with
14、in a sporangium ）节孢子Arthrospores分生孢子Conidiospores卵孢子（Oospores ）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOospores formation接合孢子 Zygospores接合孢子形成过程子囊孢子 Ascospores几种常见霉菌属主要特征分布作用与用途根霉属菌丝无隔,单细 胞迅速蔓延,有假 根,孢子囊呈黑 色,产生孢子囊 和接合孢子常长在淀粉类食 品上如馒头 、面 包、甘薯等能将淀粉转化为 糖，用于生产糖 化酶，酿造甜酒 等曲霉属菌丝分隔，分生 孢子梗顶端膨大 ，顶囊上生辐射 状小梗菌落疏松 、颜色多
15、样空气、谷物、土 壤和各种有机物 上分解淀粉和蛋白 质能力强，用于 制曲、制醋、生 产柠 檬酸、酶制 剂及糖化饲料等青霉属菌丝分隔，孢子 梗呈扫帚形，菌 落由紧密到疏松 ，多呈蓝绿 色空气、土壤及物 品上，腐烂的柑 橘上更多青霉素产生菌， 也用于制备农 用 抗生素和发酵饲 料根霉根霉的形态结构曲霉曲霉的形态结构 左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具有二层小梗青霉青霉的形态结构A单轮型 B非对称型 C对称二轮型实验内容n人们设计了各种培养和观察方法， 这些方法的主要目的是为了尽可能 保持放线菌和霉菌自然生长状态下 的形态特征。本实验采用插片法。n插片法: 倒平板插片接种培养镜 检记录绘图
16、 n压印法: 倒平板划线接种挑取菌落 加盖玻片镜检记录绘图n 埋片法: 倒琼脂切槽接种培养 镜检记录绘图 n倒平板 将培养基熔化后，倒10-12毫升左右于灭菌培养皿 内，凝固后使用. n插片 将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基 中，插入深约为1/2或1/3。n 接种与培养 用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线 ，放置28培养37天。n 观察 培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用 镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的 菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压 放于载玻片上。直接在显微镜下观察。 关键步骤及注意事项n倒平板要厚一些，接种时划线要密。n插片时要有一定角度并与划线垂直。n观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到 适当视野，更换高倍镜观察。 n如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染 色后观察，效果会更好。 思考题n镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和 气生菌丝?n你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什 么？实验六、
