《桂枝汤双向调节体温的作用机理研究——对下丘脑pka、pkc、creb活性影响及蛋白组学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《桂枝汤双向调节体温的作用机理研究——对下丘脑pka、pkc、creb活性影响及蛋白组学研究（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 前 言前言源远流长的中医药学，是我国历代劳动人民在同疾病作斗 一 争的丰富 经验总结和智慧结晶，是我国传统优秀文化遗产宝库中的一颗明珠。她 不但在以往的数千年里为中华民族保健事业和繁衍昌盛作出了杰出的贡 献，在科学 t 速发展的现在，随着人类疾病谱的改变、医学模式的转变 与回归自 然的浪潮，中医药学的优势日益得以展现，其医学价值益发为 世人所瞩目，直到今天依然是我们防病治病的重要武器。但囿于当时社 会与科学发展的水平，其理论体系和诊治疾病机制的阐释难免要留下历 史的痕迹。如何运用现代语言对其基本理论进行重新描述，如何借助现 代科学技术为其诊治疾病机理予科学解释，亦即实现中医药现代化的问 题，
2、这不论是对祖国医学自 身的生存与发展，还是就中西医结合创造我 国的新医学、新药学的角度来看，都有着重大的现实意义。作为祖国医学防病治病主要手段的方药的现代化，应是其中的关键 问题之 一 。新中国成立后，在政府的大力扶持下，中医药事业得到迅猛发展，取得了可喜的成绩。中药成分方面，从生物碱到挥发性成分，从 小分子的水溶性成分，到由多糖、月 太 直至蛋白 质等大分子化合物，展开 了广泛深入的研究。但由于天然中草药成分的复杂性、药物需配伍组方 的优越性、指导用药的方药理论的独特性等原因，中药是如何作用于人 体发挥其药效作用的，目 前仍未完全阐明，这也是中药现代化所要进一 步解决的问题。所谓中药现代化，
3、就是要使传统中药的科学经验沉积， 赋予和符合当代社会科学技术特征。中药复方药效物质和作用机理研究 是中药现代化基础研究的关键 1 。桂枝汤，出自 东汉名医张仲景的 伤寒论 ，为治疗 “ 太阳中风表虚 证”之主方。方中药物虽仅五味，但因其配伍严谨，功效独特，颇为后 世医家所推重。历代不乏探究桂枝汤效用之医家，阐释发挥甚多，其治 疗范围也由外感表证而扩展到内科、外科、妇科、儿科、骨伤科等多种 病证的治疗。虽然其治疗病症不同，但总不离其调和营卫之本功。本方 以辛甘化阳之桂枝，配以酸甘化阴之芍药， 一 散一收，一刚一柔，以此 调和营卫，复得生姜、大枣之助，甘草之和，其功更著。调和营卫的现 代解释，即为
4、对机体紊乱功能的双向调节， 此深合祖国医学 “ 协调阴阳，前 言以平为期”之医病宗旨。故有 “ 此方为仲景群方之冠，乃滋阴和阳、解肌发汗、调和营卫之第一方也”(名医方论 )之誉。我们课题组自 上世纪八十年代就开展了对桂枝汤的研究工作，结合 桂枝汤的现代临床应用， 其药效学研究证实，桂枝汤对体温、汗腺分泌、 胃肠功能、 免疫功能、血压等机体某一机能处于偏亢或偏抑的不同状态， 均可使之趋向正常水平，显示了其双向调节的作用。此后，又进一步对该方进行了药味配伍、加减拆方、服用方法及药效动力学进行了探讨。 结合药理活性筛选与化学分离的研究，获得了其对体温有双向调节作用 的有效部位A ( F r .A )
5、 、 对肠道运动显示双向 作用的有效部位B ( F r .B ) ， 以及 有降压作用的E和升压作用的B ，且这些有效部位都是有多个活性成分 构成的群体。利用多学科、多方法、多角度的研究证实，桂枝汤的双向 调节调节作用，是分别通过影响细胞调节网络中的去甲肾上腺素 ( N E ) , 多巴胺( D A ) , 5 - 经色胺( 5 - 1 1 T ) , 精氨酸加压素( A V P ) 、 神经降压素( N T ) , 血管活性肠肤 ( V I P ) 、生长抑素 ( S S ) , P 物质 ( S P ) 等神经递质、 神经 肤， 以及胞内 信号转导通路的G蛋白、 三磷酸肌醇( I P 3
6、) , 钙调蛋白( C a M) , 腺普酸环化酶 ( A C ) 、 环腺普酸 ( c A M P ) 、一氧化氮合酶 ( N O S ) 、热休 克蛋白 ( H S P ) 等多个靶点、多种环节发挥作用的。机体的体温调节中枢位于下丘脑，外源性致热源作用于机体后，导 致内生致热源诸如白 细胞介素一 1 ( I L - 1 ) 、白 细胞介素一 6 ( I L - 6 ) 、千扰素 - a ( I F N - a ) 、 肿瘤坏死因子( T N F - a , T N F - 田、 巨 噬细胞炎症蛋白( M I P - 1 ) 等的产生，改变了体温调节中枢的内环境，使体温调定点上移而发热。 研
7、究表明， 前列腺素 E Z ( P G E 2 ) 是 最重要的中 枢发热介质2 1 ， 也是内 环 境改变的主要物质。 围绕P G E : 的产生与清除， 最近我们又探讨了桂枝汤 对其主要合成酶与灭活酶如磷脂酶 A 2 ( P L A 2 ) 、环氧合酶 ( C O X ) , 1 5 - 经基脱氢酶 ( 1 5 - P G D H ) 、细胞色素P - 4 5 0 的影响。 研究结果显示，桂枝 汤可通过降低下丘 脑s P L A : 及其血管组织C O X - 2 活性， 促进恢复或升高下丘脑非血管组织 1 5 - P G D H活性，抑制下丘脑N O S活性等多种机制发 挥其解热作用3
8、一 5 ， 。研究表明，P G E 2 受体有4 个亚型，即E P 1 , E P 2 ,E P 3 和E N， 其中E P 3 可能是P G E 2 诱导体温升高的关键受体C . 7 1 。 胞内信号转导是通过多途径、多通路实现的，而 A C - c A M P - P K A和P L C - D A G - P K C , P L C - I P 3 - C a M是其中的三个主要通路， 我们以往的实验前 言观察了桂枝汤对A C , C A M P , P L C , 1 P 3 , C a M等环节的影响。 为此，本 实验拟沿前述信号转导通路， 采用 E P 3选择性激动剂大鼠 发热模型
9、R 就P K A - C R E B和P K C - N F - x B环节作进一步探讨。随着人类基因组 ( g e n o m e ) 测序工作的完成，科学工作者逐渐认识 到基因仅仅是遗传信息的载体，而生命活动的执行者是基因的表达产物 蛋白 质。蛋白 质组 ( p r o t e o m e ) ，是指一个给定的细胞或有机体在一 定的时间表达的全部相应蛋白 质，是由 澳大利亚学者 Wi l k i n s 等于 1 9 9 4 年所提出。它不仅在同一个有机体的不同组织和不同细胞中不同，在同 一机体的不同发育阶段、不同生理病理状态、不同外界环境下也不同。应该说蛋白质组有着动态、多变的特性，是否
10、正是中医学所说的证候的 物质基础， 值得探讨。蛋白 质组学( p r o t e o m i c s ) ，则是研究蛋白 质组或应 用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组 所表达的整套蛋白质的分析。蛋白 质组学已经成为新世纪生命科学研究 的前沿。能否借助蛋白组学的双向电泳方法，来探讨桂枝汤体温调节的蛋白质组学基础，也是我们试图要做的工作之一。第一章高、 低体温动物模型复制及桂枝汤的作用第一章高、低体温动物模型复制及桂枝汤的作用1 ，桂枝汤、P K A 和P K C 抑制剂对E P 3 受体激动剂致大鼠发热模型的 影响国外研究表明， 前列腺素E , 是介导体温升高的最重要
11、的中 枢介质fi , 7 我们以往的实验也发现，酵母致热大鼠下丘脑组织中P G E 。 的含量明显升 高， 脑室注射P G E , 可诱导大鼠的体温升高， 桂枝汤在对两者发挥解热作用 的同时，均可使P G E , 的含量降 低5 , IO J 。我们最近的研究又进一步证实，下 丘 脑中前列腺素的合成、代谢酶的变化与大鼠 发热有密切关系3 一5 ， 。 作为 局部化学介导因子的P G E : 是作用于哪些受体而介导了体温升高呢? 研究 表明， P G E ， 受体 ( E - s e r i e s p r o s t a n o i d r e c e p t o r , E P ) 依据药理
12、学 特性、 介导的生物功能、氨基酸序列及偶联的 G 蛋白 种类分为 4 个亚型，即 E P 1 , E P 2 , E P 3 和E P 4， 其中 E P 3 可能 是 P G E : 诱导体 温升高的 关键受体 ” 一 5 。 胞 内 信号转导是通过多个通道实现的， 而A C -c A M P -P K A 和P L C -D A G -P K C , P L C -I P :,-C a M 是其中的两个主要通道，我们以 往的实验观察了 桂枝汤对 A C , c A M P , P L C 、工 P C a M 等环节的影响。在信号转导过程中，蛋白 激酶 A ( P K A ) 和蛋白激酶
13、C ( P K C ) ，是胞内信号转导的关键的两个酶。为此，我 们选用了一种E P 3 选择性激动剂s u l p r o s t o n e ， 通过侧脑室注射( i c v ) ， 成 功复制了 大鼠 发 热模型H 。 本实验拟采用此模型， 就P G E : 通过胞内 信使传 递信号 到细胞核过程的几个环节，探讨桂枝汤的解热作用机理。1 . 1 材料 药物及试剂 s u l p r o s t o n e ， 购自 C a t m a n 公 司 ， 扎 踢为 1 9 1 1 6 a ; C A L P H O S T I N C, L o t 6 1 K 1 5 6 2 1 , N -
14、 ( 2 - p - B R O M O C I N N A M Y L A M 工 N O E T H Y L ) - 5 - I S O Q L 工 N O L N E S 几 F O N A M 工 D E “ ) , L o t 1 2 K I I 3 7 ， 均为 S I G M A 产品。 人工 脑脊液 ( A C S F ) 参 照文献 9 配制( m m o l . L - 1 :N a C l 1 2 6 , K C 1 6 , N a H 2 P O 4 1 ，M g S 0 4 0 . 8 8 , C a C 1 2 1 . 4 5 , H E P E S 2 5 ) .
15、 S u l p r o s t o n e ( S u l ) 、C a l p h o s t i n C ( C a l C ) 精密吸取其所需 乙醇溶液量，氮气吹干。临用前分别将二者及H - 8 9 ，均以A C S F 配成所需 浓度溶液，其中C a l C 在8 W 日 光灯下1 5 c m 处光照6 0 m i n 激活。桂枝 ( 广西上思) 、赤芍 ( 内蒙多伦) 、甘草 ( 内蒙杭锦旗，由北京 卫仁饮片厂蜜制) 、生姜 ( 山东莱芫) 、大枣 ( 1 l 西柳林) ，经生药学鉴定分别为 C i n n a m o m u m c a s s i n P r e s l . ,
16、 P a e o n i a l a c t i f l o r a P a l l . ,G l y c y r r h i z a u r a l e n s i s F i s c h .，Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s e .，第一章高、低体温动物模型复制及桂枝汤的作用Z i z i p h u s j u j u b a M i l l . 。按原方比例1 0 : 1 0 : 7 : 1 0 : 1 0 配齐药物 ( 生 姜切片，大枣剖开) 混合，加入 5 倍蒸馏水 ( W / W )浸泡 6 0 分钟，快速 加热至沸腾，而后保持微沸状态 巧分钟，趁热抽滤:剩余药渣中加入 3倍蒸馏水，浸泡 3 0分钟，快速加热至沸，微沸 1 0分钟，趁热抽滤。合 并两次滤液，水浴浓缩至 l k g 饮片/ L , 4 0 C 储存备用。 动物雄性W i s t a r 大鼠，体重2 2 0 8 12 0 g ，由中国医学科学院实验动物 研究所提供，合格证号
