《p糖蛋白对mcf-7adr细胞辐射敏感性负调控机制的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《p糖蛋白对mcf-7adr细胞辐射敏感性负调控机制的初步研究（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中文摘要目的：细胞多药耐药( M D R ) 是当前困扰临床肿瘤治疗疗效的主要障碍。M D R l 基因编码产物P 糖蛋白( P - g p ) 的过度表达被认为在M D R 形成机制中占有重要的地位。肿瘤细胞对化疗或放疗存在交叉抵抗现象。新近的研究认为化疗或放疗可能存在着耐药基因( M D R l ) 、B c l 一2 基因等基因水平的相同的调控机制。可能正是由于此相同的调控机制，使肿瘤细胞产生了交叉抵抗性。同时当前的研究，说明了P g p 与肿瘤细胞的放射抵抗表型存在着现象上的直接关系，提示P g p 可能呈递了肿瘤细胞对x 射线的抵抗机制，但它们的具体作用机制仍未明确。本实验就在适量x
2、 射线诱导细胞凋亡的条件下，通过抑制耐药细胞P - g p 功能，观察耐药细胞对x 射线敏感性的变化，并初步探讨了产生这种变化的可能机制。本研究为进一步阐明P g p 在放射抵抗中所起的作用，进而逆转放化疗抵抗现象以及为放化疗逆转剂的研制提供新的思路和实验依据。方法：M T T 法检测M C F - 7 和M C F - 7 A d r 细胞耐药性；以X 射线照射Mc F 一7 A d r 细胞；以V e r a p a m i l 抑制细胞P g p 功能；流式细胞术检测敏感细胞和耐药细胞株P g p 表达，检测x 射线照射后各时间点M C F 一7 A d r 细胞细胞凋亡率的变化、细胞线
3、粒体膜电位( t Y m ) 、胞浆C y t o c h r o m eC的表达、胞浆C a s p a s e 一3 活性：采用S P S S I O 0 统计软件包进行统计分析，应用t 检验和方差分析处理数据。结果：M T T 法检测细胞耐药性，A D R 和V C R 对M C F - 7 细胞的I G 。值( g m I ) 分别为0 5 2 4 - 0 2 5 和0 7 5 - 4 - 0 6 1 ；对M C F 一7 A d r 细胞的Ic 5 0 值分别为2 5 7 5 1 5 7 和1 0 4 4 3 2 1 。A D R 和V C R 对M C F 一7 A d r 耐药细
4、胞的I c 的值分别是M C F - 7 敏感细胞的4 9 5 倍和1 3 9 倍。M c F 一7 A d r 耐药细胞P g p 阳性百分率和平均荧光强度值分别是8 7 5 0 6 0 8 和4 4 1 4 + 4 92 I ：M C F 一7 敏感细胞分别是7 6 7 1 4 6 和4 5 2 - k - _ 0 6 9 ，M C F 一7 A d r 耐药细胞P g p 表达明显高于M C F - 7 敏感细胞( P l ：2 ，细胞存活；反之则细胞凋亡当B a x 蛋白表达增加时，B a x 同源二聚体形成增加，便诱导细胞凋亡；当B c l 2 蛋白表达增加时，B a x 二聚体逐渐
5、分开，形成了比后者更稳定的B c l 2 _ _ B a x 异源二聚体，B c l 2 同源二聚体形成也增加，就抑制了细胞凋亡B c l - x l 与B e l 2 同源，功能也相同，可以抑制细胞凋亡，而B c l X S 则正好相反当B c l ) 【s 存在时，优先与B c l 2 形成异源二聚体，而游离的B a x 形成同源二聚体诱导细胞凋亡当B a x 的浓度达到O 2 5 10 0 m m o l L 时，细胞进入凋亡程序心”故B a x 启动细胞凋亡的模式在B c l 2 家族调控细胞凋亡中有重要的作用2 5C a s p a s e 酶与细胞凋亡C a s p 私e 是半胱氨
6、酸天冬氨酸蛋白酶( c y s t e i n y la s p a r t a t e - s p e c i f i cp r o t e i n a s e ) 的简称，是类位点特异性的蛋白水解酶，这类酶与诱导线虫凋亡的C E D 3 具有结构和功能上广泛的同源性，是细胞凋亡信号的传导者及细胞凋亡的执行者目前在哺乳动物细胞中己发现了1 4 种c 鹤p 稿e 家族成员，它们均具有相似的氨基酸序列，二级结构及底物特异性根据其功能不同，可大致分为启动和效应两个部分启动部分主要起激发和调节凋亡的活化作用，以C a s p a s e 2 ，C a s p a s e 8 ，C a S p a s
7、 e 9 ，C a s p a s e l 0 为代表，都含有一个死亡效应域( D E Dd e a t he f f e c t o rd o m a i n ) 结构；效应部分主要起蛋白质酶解作用，可以直接水解与细胞解体相关的结构和功能蛋白，以C a s p a s e 3 ，C a s p a s e 6 ，C a s p a s e 7 为代表n ”“C a s p 嬲e 对底物的裂解部位是在特定的天冬氨酸酶之后的羧基端残基，而C a s p a s e 酶原的激活也是在其天冬氨酸位点被裂解，这样被激活的C a s p a s e 可以裂解其它的C a s p a s e 酶原，最终形
8、成酶级联放大效应C a s p a s e 的激活可以是线粒体依赖，也可以发生在细胞膜的死亡受体复合体而C a s p a s e 3 无论在线粒体途径或是死亡受体途径所致的细胞凋亡中都是必需的”印C a s p a s e 3 通过对其底物( 如蛋白激酶，结构蛋白，核酸酶抑制物) 裂解而激活特定的信号系统，产生核皱缩及D N A 片段化在正常细胞中，I C A D ( I n h i b i t o ro fc a s p a s ea c t i v a t e dD N a s e ) 与C A D ( C a s p a s ea c t i v a t e dD N a s e )
9、结合，前者抑制后者的活性而在细胞凋亡过程中，激活的C a s p a s e 3可直接分解I C A D ，C A D 便游离入细胞核，分解核染色体，使D N A 片段化n 72 s l2 5 1 线粒体途径在x 射线等因素作用下，细胞M P T P 开放，膜电位降低或丧失，各种凋亡因子释放入胞浆，其中C y t - c , A p a f - 1 ，C a s p a s e 9 复合物在A T P 存在条件下进一步激活效应C a s p a s e 3 ，使细胞凋亡进行下去而C a s p a s e 3 又作用于线粒体，使C y t - c 大量释放，这样就形成了一个自身反馈的放大机制，
10、使凋亡过程持续及加速乜“S l e e 则认为C a s p a s e 3 使B i d 裂解激活，进一步作用于线粒体致后期C y t - e 的释放口们2 5 2 死亡受体途径死亡受体R ) 位于细胞膜上，包含有一个具有明显蛋白水解功能的被称之为死亡结构域的细胞质区域，在连接分子( a d a p t o r s ) 的媒介作用下激活C a s p a s e 8 ，进一步激活C a s p a s e 3 而水解相应底物致细胞凋亡1 目前有多个D R 的C D N A 序列已清楚，它们是F a s ( C D 9 5 a p o 1 ) ，肿瘤坏死因子受体-I ( T N F R - I
11、 ) ，死亡受体一3 ( D R - 3 ) ，D R 4 ，D I L 5 4 E 3讨论x 射线诱发细胞凋亡的机制与其它因素诱发细胞凋亡的机制大致相同。除上述的一些途径外，还有如C m y c 基因通过控制转录而诱导细胞凋亡，癌基因r a s 可启动不依赖于P 5 3 基因的细胞凋亡反应等等。由于细胞凋亡是多因子共同作用的结果，在凋亡的进程中存在多因素的诱导或抑制作用，有多种形式的反馈放大模式，所以对其形成机制仍有待于进一步的深入研究。x 射线的剂量不同，它所诱导的细胞凋亡的情况也不一样，S h i n o m i y a 认为对于U 9 3 7 细胞，在高剂量( 2 0 G y ) 时诱
12、导一个快速而强烈的细胞凋亡：在低剂量( S G y ) 时诱导个缓慢而温和的细胞凋亡口”在不同的细胞，诱导凋亡敏感的剂量也不一样有研究表明，总辐射剂量相同的条件下，多次低剂量辐射远比单次或两次高剂量辐射诱发的生物学效应大在x 射线诱发的细胞凋亡中，P 糖蛋白，线粒体膜，C a s p a s e 酶家族，B c l 。2 家族常被认为是最重要的元件P 糖蛋白过表达对细胞凋亡的负调控机制仍未明确可能是由于x 射线促使P 糖蛋白表达增多，而P 糖蛋白的细胞膜流出泵作用使C y t C ，C a s p a s e 酶等凋亡因子减少，最终抑制了细胞凋亡。“线粒体在细胞凋亡中作用勿庸置疑，但也存在着非
13、线粒体依赖的细胞凋亡途径，且启动和诱导因子在细胞内外的定位和作用也存在着较多争议C y t C 的释放被认为至少有与M P T P ，电压依赖通道，多种细胞膜表面通道有关的三个独立的机制“1 而C a s p a s e 酶的激活可能需要一个酸性的细胞质环境口”，C a s p a s e 2 过表达使B i d 从胞质移位到线粒体进而引起C y t - c 的释放增加汹1 ；而对C y t - c 释放的抑制，可能与B c l 一2 的过表达而直接作用于线粒体膜有密切关系n ”。相信今后随着对x 射线诱导细胞凋亡机制更为深刻的认识，在细胞和分子水平一定能够明确多种凋亡途径，也能更好地指导临床
14、运用电离辐射治疗肿瘤等相关疾病；而对细胞凋亡促进剂和抑制剂的研究的深入，将产生毒副作用小、能在临床广泛使用的细胞凋亡促进或抑制药物。4 6 参考文献：1E v e n ，G ，1 i t t l e w o o dT Am a t t e ro f 1 i f ea n dc e l ld e a t h S i c e n c e ，1 9 9 8 ，2 8 1 ：1 3 1 7 - 2 22B u r n sT F ，B e r n h a r dE J ，D e i r yw s T i s s u es p e c i f f ce x p r e s s i o no fp 5 3t
15、 a r g e tg e n e ss u g g e s t sak e yr o l ef o rK I L L E R D R 5i np 5 3 一d e p e n d e n ta p o p t o s i si nv i v o ，2 0 0 1 ，2 0 ( 3 4 ) ：4 6 0 1 - 1 23P o l y a kk Am o d e lf o rp 5 3 一i n d u c e da p o p t o s i s ，N a t u r e ，1 9 9 7 ，3 8 9 ：3 0 0 54M i y a s h i t aT p 5 3 一m e d i a
16、 t e da p o p t o s i s ，T a n p a k u s h i t s uK a k u s a nK o s o ，1 9 9 7 ，4 2 ：1 6 5 7 6 35O g a w aY ，N i s h i o k aA ，K o b a y a s h iT R a d i a t i o n i n d u c e da p o p t o s i so fh u m a np er i p h e r a lTc e l l s ：a n a l y s e sw i t hC D N Ae x p r e s s i o na r r a y sa n dm i t h c h o n d r i a1m e m b r a n ep o t e n t i a la s s a y ，2 0 0 1 ，7 ：6 0 3
