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1、试剂：1. 5x 样品缓冲液（ 10ml）:0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl （Tris-HCl缓冲液（ 0.05mol/L ，25）50ml 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至 100ml）(pH6.8),5ml 50% 甘油，2ml 10% 的 SDS ，0.5ml 巯基乙醇， 1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在 4保存数周，或在 20保存数月。H2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4保存，一般可放置1 个月。3.
2、 pH8.9 分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水 80ml使其溶解，调 pH8.9，定容至 100ml， 4保存。4. pH6.7 浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水 80ml使其溶解，调 pH6.7，定容至 100ml， 4保存。5 v) L: Q, N7 5. TEMED （四乙基乙二胺）原液。; _ Z0 Z1 g V( M# p* t/ O6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。+ q! c* B0 a+ p1 j+ k, I6 G h1 d7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓
3、冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸 28.8g，加蒸馏水约 900ml，调 pH8.3 后，用蒸馏水定容至1000ml。置 4保存，临用前稀释10倍。8. 考马斯亮蓝 G250染色液：称 100mg考马斯亮蓝 G250 ，溶于 200ml 蒸馏水中，慢慢加入 7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌 1 小时，小孔滤纸过滤。: s! o# E e% W. hSDS-PAGE 凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）1512.5107.55.0线性分离范围15-435kDa15-60kDa18-75kDa30-120 kDa60-212 kDa器材) 2 q c$ 7 M$ U*
4、s4 e a样品制备将蛋白质样品与 5X样品缓冲液 （20ul 5ul ）在一个 Eppendorf 管中混合。 放入100加热 510min，离心，取上清点样。* t( A) i; a“ ( g电泳8 l# j“ s) S! j. b1. 将玻璃板、样品梳、 Spacer 用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；4 * P# j2 G: h: G% M 2 6 u2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制 10分离胶 8.0 ml ，混匀；1 ; _5 w2 n: F C# c“ / ?ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-
5、HCl pH=8.8 2.1 ml; K7 Q1 n4 |7 6 R+ 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul4 q- . o9 s“ p5 A“ A: k4 N1 V“ TEMED 6 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* * A: $ ? y4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min 后胶即可聚合；) 5. 按如下体积配制 6浓缩胶 3.0 ml ，混匀；ddH2O 2.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ulQ1 n4 |7 6 R + 30% Acr-Bis 600 ul 10%
6、 SDS 36 ul 10%AP 24 ul4 q- . o9 s“ p5 A“ A: k4 N1 V“ TEMED 4 ul$ r, Q8 l( m/ l; j* * A: $ ? y6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 l;- Q4 Y3 p5 e6 O3 Y0 8. 稳压 200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min 1hr；P7 E9 t C试剂配制步骤0 T2 o- m! n* Y3 C1. 固定液：冰醋酸 : 甲醇: 水（10:20:70 ）2. 电泳后的凝胶用 510 倍体积固定液在室温下固定，酸性固
7、定液扩散后可使凝胶中的溴酚蓝变黄。蓝色全部消失后，继续固定5min。为防止凝胶破裂，在进行此步骤之前可将凝胶浸泡于含20% 甲醇、 30% 甘油的溶液中过夜。& A4 Q: Y# - E9 V- 3. 将凝胶标记好方向后放在保鲜膜或玻璃纸上面，上面放一张比凝胶四周长出12cm的 Whatman 3MM 滤纸。4. 另将一张滤纸放在凝胶干燥器上。将Whatman 3MM 滤纸/ 凝胶/ 保鲜膜或玻璃纸，放在凝胶干燥器上的滤纸上面，保鲜膜或玻璃纸在最上面。6 j1 “ _ e1 ( y$ J0 l5. 放下凝胶干燥器的盖子，抽真空使凝胶四周封闭以干燥凝胶，干燥时间常由厂家提供，一般 0.75mm厚
8、凝胶干燥 2h，如 5065可加快干燥进程。/ Y7 n0 L% B6 6. 释放真空。如加热状态下干燥，则先停止加热并自然冷却10min 后再释放真空。二蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967 年 Shapiro 等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS ），大多数蛋白质能与SDS 按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g 的 SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在
9、一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。操作步骤1、凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。2、上样：分别取样品若干ml 于离心管中， 按 1/1 1/5 比例加入5 样品缓冲液， 再沸水浴中加热35min ，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30l 不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。 点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（23mA/em ），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底12cm 时，即可停止电泳。3、染色：电泳完毕后， 取出凝胶板， 浸入染色液中， 在 37温箱中保温过夜。倒掉染色液， 24h 后，即可看到清晰的蛋白质条带。
