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1、南开大学硕士学位论文用微生物总数评价天津梅江管道直饮水厂工艺的处理效果姓名：刘蕾申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：郝越力20070501摘要摘要管道直饮水是中国提升饮用水水质的快捷途径，目前在全国许多地区得到快速发展。天津梅江管道直饮水厂建于1 9 9 9 年，为国内较早建立的大型示范性直饮水厂，供水人数达到6 万人。水厂处理工艺采用混凝、生物脱氮、砂滤、活性炭吸附、臭氧氧化及二氧化氯消毒等工艺对自来水进行深度处理，以提供高品质可直接饮用的健康饮用水。对该工艺去除微生物的效果进行研究是优质饮用水评定的一个重要方面。该项研究采用荧光显微镜计数方法对工艺流程和用户终端出水中的微生物总数进行
2、了详细的测定。荧光染色剂包括A O 、D A P I 、P I 及C T G 工艺流程取样包括所有的6 个工序出水点；用户终端包括4 个居民小区：观测时间跨越四个季节，近一年时间；观测频度为每月一至两次。通过大量观测发现水中微生物总数较低，通常每毫升所含菌数在几万个，活菌数在数千个。在九次取样测定结果中，虽然出厂水所含菌数有时高于自来水原水，但通常低于或显著低于( P 0 0 5 m g L 细菌总数：5 0 C F U m l大肠菌群：O C F U I O O m lI 2 2 工艺流程工艺流程图示城市自来水一闪速混合絮凝一臭氧氧化生化一臭氧氧化一砂滤恬性炭吸附臭氧氧化保质一用户以天津城市
3、自来水为原水，通过快速分离器进行闪速混合沉淀，再经过进一步混凝后进入斜板沉淀池沉淀，出水经臭氧氧化后，再进入斜板生化池去氨氮，进行第二次臭氧氧化，经砂滤池过滤，再通过活性炭池过滤，进行第三次臭氧氧化处理，然后加二氧化氯消毒，保质后，通过变频泵输送给用户工艺参数臭氧发生器：臭氧由电击产生闪速混凝( 又叫快速分离器) ：采用添加聚合氯化铝混凝剂进行混凝沉淀分离，机械搅拌。进一步混凝：低温低活，该混凝罐为4 米深。斜管沉淀池：紊流，浊度为0 5 - 0 7 N I “ 0臭氧氧化：逆向臭氧氧化，反应1 5 分钟，废气焚烧。斜板生化池：深5 米，生化罐反应搅拌，此罐进行生化反应，用来去氨氮，底部排污泥
4、，自然形成生物床，斜板为聚乙烯塑料制成。臭氧氧化：上一步的臭氧耗量大，此处的臭氧耗量小，反应1 5 分钟。砂滤池：底部为鹅卵石装有真空滤池6第一章前言炭滤：活性炭过滤，为粒状活性炭，活性炭深1 5 米，约为1 吨二氧化氯：出厂水中加入二氧化氯保鲜，变频泵( 六层以上用高压泵) 。管道：使用P P R ，P E 管，管口内径为9 0 m m ，外径为l l O m m l ，管内压力为0 2 2 M p a第三节微生物总数计数1 3 1 微生物总数概述田。硼一直以来，计算饮用水中微生物总数的方法是传统的平板计数法( H P c ) 和最大可能数法( M P N ) ，然而传统的平板计数法并不精确
5、，它存在着许多问题。首先各种微生物都有各自的生长特性、营养要求和繁殖条件面对不同的培养条件，微生物的繁殖状况是不同的，因此计数结果也有差异。在微生物计数中一般选用营养琼脂培养基m ，它只能检测到营养琼脂培养基上所能生长的微生物，由于水中微生物种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能在营养琼脂培养基上使水中所有的微生物均能生长繁殖。即便是选择效果更好的培养基( 如R 2 A 培养基) ，其结果也不能代表水体中的全部微生物。因此，不可能找到一种培养基在一种培养条件下，就能培养出水中的全部微生物，而以一定的培养基上生长出来的菌落计算出来的微生物总数可与实际数量相差甚远其次，传统的平板
6、计数法的另一重要问题就是其检出率是要以培养基平板上所形成的单个菌落为计数单位，而在被检测的样品中，微生物体经常未能充分分散，它们通常以单个、双个，甚至链状成堆繁殖，但不管按以上哪种形式繁殖，都只形成一个菌落，这就是微生物的聚集生长状态，结果必然导致检测结果的误差。再次，传统的微生物计数方法，要求让微生物生长繁殖到肉眼可见的状态，因此所需的培养时间较长。培养基组成的不同，培养条件则不同。如琼脂培养基2 4 h 为宜，而R 2 A 培养基需要对微生物进行较长时间的恢复生长，一般为2 至t 3 天，因此都无法了解微生物的即时状况，及对突发情况的研究。前面指出一种培养基不可能将所有的微生物都培养出来在
7、自然界中，绝大多数的微生物是未知的，约有9 0 * , 6 以上的微生物尚未被分离鉴定出来。2 0 世纪8 0 年代初提出了“活的非可培养状态”( 自然界中处于V B N C 状态微生物的研究进展) 。它是指微生物存活但不可培养，这是由于微生物受到外界不良环境的压力刺激后，通过一系列类似分化的遗传程序如细胞缩成球形，而使自身处于一7第一章前言种能抵抗饥觎和压力的状态。有许多处于“活的非可培养状态”下的微生物我们不知道它们的营养要求和培养条件，因此不能在一种培养基上培养出所有的微生物。在饮用水的环境中，经过各步骤的处理，微生物受损伤很大，再加上贫营养环境，使得许多微生物在饥饿的情况下可以通过一系
8、列的细胞生理和形态变化而存活很长时间，进入微生物的“活的非可培养状态”，这时候用常规方法培养不能使其生长繁殖。到目前为止，微生物学家们已发现有许多人类致病细菌在受到环境压力时，特别是饥馘状态时会进入“活的非可培养状态”，比如有些革兰氏阴性病原菌，创伤弧菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、索氏志贺氏菌、杀鲑气单胞菌和空肠弯曲杆菌等，当它们处于低温和贫营养的环境中时，可以进入这种活的非可培养状态，而并非死亡了。进入活的非可培养状态的细菌在一定的条件下可以复苏并仍具有毒力，那么用传统的平板计数法就无法将其检出，就有可能会在实践中造成漏检，使活的非可培养状态的致病细菌在特定的条件下复苏造成该病的暴发性流行荧光
9、显微镜直接计数法是一种非培养的微生物计数方法，它是通过荧光染色剂对样品中微生物核酸及其它组分进行染色，对样品环境中微生物总数，活体微生物总数及死体微生物总数进行快速，直接的镜检计数方法根据染色目的的不同，所采用的荧光剂及染色方法也有不同，最常用的方法有：用于微生物总数的吖啶橙染色直接计数( A O D c ) ，活菌直接计数( D V C 法) ，死活茵的直接计数( L I V E D E A DB a c l i g h t ) 法等。这些方法充分克服了传统平板培养方法的不足，使得不能在传统培养方法下生长繁殖的微生物体可以通过染色在荧光显微镜下观测到并弥补了传统培养方法培养时间较长，准备条件
10、复杂等问题，使得检测过程快速、全面、简便，且样品易于保存，用于水中微生物总数测定能较好反映微生物的实际总量。1 3 2 荧光显微镜m 。捌荧光显微镜直接计数法的一个重要的工具就是荧光显微镜。它是光学显微镜的一种，其原理是将特定波长的光照射被检测物质，使之产生荧光，最后通过物镜和目镜系统放大镜检的显微光学观测技术。它除了具有一般光学显微镜的基本结构和光学放大作用外，与普通的光学显微镜相比还多了荧光装置。8第一章前言荧光显微镜观测的目的就是让待测物质产生荧光，进而观察。荧光是指物质受到波长较短( 能量较高) 的光照射时，会发射出波长较长( 能量较低) 的光。这是因为物质在接受某种特定波长的高能量光
11、( 短波长) 照射后吸收能量，几乎即时( 约在1 0 1 5S 后) 其分子内的电子由较低的能级跃迁到较高能级轨道，即使分子由基态进入激发态，但是因为不稳定，这些分子就会立即释放多余的能量回到基态，其中一部分化为热量而消失。所释放出相应较低能量的光量子即荧光。因此物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。激发光的光谱包含紫外线、蓝光，黄绿光等波段。所产生的荧光光谱与可见光一样包括红、橙、黄、绿、青、蓝、紫，有的物质标本只有一种颜色荧光，但有的物质标本有多种颜色荧光。自然荧光( 或称一次荧光、自发荧光、自体荧光和原发荧光) ：某些物质不需处理，当受到激发光照射就能产生荧光的称为自然荧光。这类物质含有
12、共轭双键。继发荧光( 或称二次荧光、人工荧光、染色荧光) ：某些物质经照射后不能或只能发出微弱的荧光，必须和其他物质结合( 如用荧光染色剂，荧光色素) ，才能在激发光下发射荧光。荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某轴分布，形成镜象关系。荧光的衰减是指在受激发光照射期间，发出的荧光光强的减弱。衰减的程度取决于激发光强度和照射时间。采用高强度激发光时其衰减要显著得多，有时在1 秒的间隔内，荧光就会大大减弱。荧光还有猝灭现象，特别对于继发荧光，这是一种复杂的现象，由于处于激发状态的荧光发色团分子发生了变态，导致荧光量子产量的减少，这样便缩短了荧光的发射。基于荧光的特性，需要提供足够能量的能激发出荧光
13、的光源。因此在荧光显微镜的构成中，光源的选择非常重要，它取决于所需检测的荧光物质的吸收光谱，荧光染色剂的平均吸收波长峰值从紫外( 3 4 0 1 恤) 到黄绿光( 5 9 5 衄) 。超高压汞灯是产生这些光谱的最常用的光源，它是利用金属汞蒸汽在超高压下放电发光原理制成的。光度极强2 x1 0 8 c d m Z 3 X1 0 8 c d m s 。发光光谱为2 8 0 n m 6 0 0 h m ，具有不连续的线条光谱特性，有的波段特别明亮。滤色系统是荧光显微镜的重要组件，按其功能可分为激发滤色片( 第一滤板) 和压制滤色片( 第二滤板) 两类。激发滤色片是由一套不同激发光谱的滤色片组成，根据
14、不同的标本物质，从光源中分析出所需的特定光谱，选择合适的激发滤色片，提供一定波长范围的激发光，使析出的光谱与该标本物质的吸收光谱重合，激发标本物质产生荧光。压制滤色片是由一套不同光谱的压制滤色片组9第一章前言成，只能使标本物质上发出的荧光透过成像，而将其它光包括发射光阻挡不参与成像，这样可以提高图像的对比度。一般的荧光显微镜的激发滤色片安置在靠近光源的位置，而压制滤色片在物镜与目镜之间。滤色片按其透过光谱特性曲线可分为“短波通过”、“长波通过”和。波段通过”滤色片。“波段通过”滤色片按波带宽度又可分为“宽波带”和“窄波带”滤色片。激发滤色片一般按激发光谱分为：紫外区( U v ) 波段在3 4
15、 0n m 3 8 0n m 。小于4 0 0r i m ；紫蓝区( v ) 波段在3 9 0n m 4 6 0n m ；蓝光区( B ) 波段在4 6 0 衄5 0 0i l m ：绿光区( G ) 波段在5 0 0n m 5 7 0 衄，目前还有黄光区( Y ) 波段在5 7 0姗5 9 5 衄之间，各厂家在各激发区内还进行细分。细分的原则是按不同的激发波带宽度和峰值，如在B 激发中分为4 0 0n m 4 9 0n m ；4 2 0 珊4 9 0r i m ；4 5 0r 珈 4 9 0n m ；4 6 5n m 4 9 5 舳和4 7 0n m 4 9 0 衄5 种。压制滤色片要阻挡非
16、荧光在象面上出现，来自被检物体的杂散光和反射光一旦进入观察系统后会使对比度降低，因为它比荧光具有更高的亮度。对于压制滤色片的要求是它的光谱特性和它是否产生自发荧光。压制滤色片的光谱特性，除了要考虑荧光的发射光谱外，还需注意到激发光谱往往与发射光谱有一重叠区的处理。由于荧光大都在4 0 0r u a 6 6 0a m 区域内，若用长波通滤色片，起始透射谱线为4 0 0 h m ，每隔1 0n m 3 0 衄增加。一般配备1 0 片即可满足了。大多数荧光染色剂和荧光发色团分子具有相当宽的吸收光波带和荧光波带，峰值间隔又较大，所以在需要得到强荧光时，很少使用窄波带滤色片，因为它可导致大量的光源能量损失，仅在光源的强发射谱线和激发时的吸收峰相重合时才使用。当使用宽波带滤色片时，往往样品成分和光路中的自发荧光会被这类滤色片中的短波光激发出来，加到荧光图象中而混扰。多数应用中。激发滤色片的半宽约2 0 h m 就能给出满意的结果。1 3 3 荧光染色剂荧光染色剂( 荧光色素) 是一类与不发
