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1、 人类主要分子人类主要分子 特异性引物片段特异性引物片段 HLA-B*1502 荧光分型试剂荧光分型试剂 HLA-B*1502 Real-Time PCR Typing Kit 操作说明书操作说明书 Research Use Only 国内首创国内首创，国际领先国际领先！Taqman 探针技术探针技术！ 产品名称产品名称：HLA-B*1502 等位基因分型荧光探针等位基因分型荧光探针 PCR 试剂盒试剂盒 检测原理检测原理： 由已知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针，当引物序列与待测标的序列能完全配合时，引物进行聚合酶链锁反应。特殊核酸 片段将被进行复制与放大，同时探针结合
2、上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用产生荧光。荧光反应产生表示在样本中存在与特异性引物匹配的目的基因 序列，反之则否。 检测意义：检测意义： HLA-B*1502 等位基因已被证实与汉族人群因服用精神科常用药物卡马西平引起的史蒂芬-琼森症候群 (Steven-Johnson Syndrome, SJS)以及临 床上致死高达 30%的毒性表皮坏死松解症(Toxic Epidermal necrolysis, TEN)有高的关联性。研究发现，带有 HLA-B*1502 基因的病患如果服 用此药，引起此两种症的严重药物过敏机将比一般人高了 1931300倍。据可靠统计，中国人群中携带 HLA-B*1
3、502 等位基因的比率超过 10%。因此，通过检测 HLA-B*1502 等位基因是否携带，可降低患者服用卡马西平诱发 SJS/TEN的风险。（美国 FDA及日本，台湾等地的医疗 监管部门已明确要求医生在对亚裔人群使用卡马西平前，必须进行 HLA-B*1502 基因检测，并且此项检测已纳入医保范围。） 产品特点：产品特点： 特异：基于荧光探针 PCR 方法，特异性比普通 PCR 和荧光染料 PCR 的方法更高 准确：用三个反应孔进行扩增，每个反应孔均含特异性引物和探针及内对照引物和探针，最 大限度的分出 HLA-B*1502 型别 简便：操作简单，无需电泳 省时：检测时间短， 约一小时完成检测
4、 可靠：质控过关，结果可靠 防污染：无需进行电泳，防止电泳过程中的污染 检测流程：检测流程： 结果判读：结果判读： 每份样本测试时需同时进行MIX1,MIX2,MIX3 三管反应。 1、 反 应 体反 应 体 系配制系配制 3、结果判、结果判 读读 2、 荧 光 定 量荧 光 定 量 PCR 反应反应 分析项 目 内对照 /Ct MIX1 Ct MIX2 Ct MIX3 Ct 结果判定 检测波 长 HEX FAM FAM FAM 待测样 本 35 35 / / B1502DNA阴 性 / 30 / 35 B1502DNA阳 性注 1 35 30 30 30 重新测定 35 35Ct3 0 35
5、Ct3 0 35Ct30 重新测定 注 2 注: “/”表示不考虑 注 1: Indicates as B*1502, B*1588, B*1589, or B*9521 注 2: 如还是同样结果则判定为阴性 订购信息：订购信息： 产品编号 产品名称 规格 备注 Pharmcogenomics TM001 HLA-B*1502 Typing Kits 20T / Kit 联系方式：联系方式： 地址：江苏省泰州医药高新区药城大道一号双子楼九楼 225300 电话：0523-86201335 转分机 产品咨询：8002 技术咨询：8007 传真：0523-86201325 网址： 邮箱：（产品咨询
6、） 上海办事处：上海市徐汇区蒲汇塘路 158号 201 室 电话：021-34615308 手机：18801820725/13681860725（张先生） 本品仅供科研使用！本品仅供科研使用！ 目录目录 1. 效能效能 2. 摘要与描述摘要与描述 3. 原理原理 4. 试剂试剂 4.1人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段 B1502荧光分型试剂内容 4.2 警告及注意事项 4.3 储存条件 4.4 使用规范 5. 设备需求设备需求 5.1 荧光聚合酶链反应仪 6. 样本收集及前处理样本收集及前处理 6.1 血液样本采集 6.2 核酸样本提取 6.3 核酸样本定量 6.4 核酸样本质量规范
7、7. 操作说明操作说明 7.1 套组包含对象 7.2 套组未包含必需使用对象 7.3 样本前处理 7.4 试剂/设备 7.5 荧光聚合酶链反应 8. 实验结果实验结果 8.1 结果判读 8.2操作规范 1. 效能效能 本试剂利用核酸检测（荧光探针 PCR法），提供 HLA-B*1502型别鉴定。 2. 摘要与描述摘要与描述 人类主要组织相容性抗原分子(Human Leukocyte Antigen,简称 HLA) 位于人类的第六条染色体的短臂上，共分成两大类，第一类有 A、B、C三种，第 二类有 DP、DQ、DR；不同人类个体之间的 HLA 具有高度多态性(Highly polymorphis
8、m)，目前研究已知 HLA对于 T 细胞免疫的专一性鉴别以及一些临床疾 病的用药判断扮演极重要的角色1。 HLA-B*1502 为 HLA-B位点型别的其中一种，HLA-B 1502即是其中一个基因，且已被证实与汉族人群因服用卡巴西平药物引起的史蒂芬琼森症候群 (Steven-Johnson Syndrome, SJS)以及临床上致死高达 30%的毒性表皮坏死松懈症 (Toxic Epidermal necrolysis, TEN)有高 的关联性。根据研究发现，带有 HLA-B 1502基因的病患如果服用此药，引起此两种症的严重药物过敏机将比一般人多 1931300倍的风险。 本人类主要组织相
9、容性抗原分子特异性引物片段 HLA-B*1502 荧光分型试剂以序列特异性引物进行荧光聚合酶链反应用于人类主要组织相容性抗原分子型 别鉴定。 3. 原理原理 人类主要组织相容性抗原分子特异性引物片段 HLA-B*1502 荧光分型试剂，以序列特异性引物进行荧光聚合酶链反应用于人类主要组织相容性抗原分 子型别鉴定。首先由已知人类主要组织相容性抗原分子基因序列设计特异性引物及探针，当引物序列与待测标的序列能完全配合时，引物进行聚合酶链锁 反应。特殊核酸片段将被进行复制与放大，特殊核酸片段复制与放大的同时探针结合上待测标的序列并藉由聚合酶的分解作用产生荧光。荧光反应产生表 示在样本中存在与特异性引物
10、完全相同之基因序列，反之则否。 同时在荧光聚合酶链锁反应试剂中，也加入了另外一对内部对照组的核酸引物及探针，进行一常存基因-囊胞纤维膜基因的核酸片段放大侦测，其目的 在于证明聚合酶链锁反应的正常进行，当样本中的人类主要组织相容性抗原分子核酸片段被复制放大时，内部对照组基因核酸片段将有可能因放大效率的 差异而受到抑制。 人类主要组织兼容性抗原分子特异性引物片段 HLA-B*1502 分型试剂提供 HLA-B*1502 主反应液及分型反应液进行聚合酶链锁反应，达到人类主要组 织兼容性抗原分子 HLA-B*1502型别鉴定分析。 4. 试剂试剂 4.1 人类主要组织兼容性抗原分子特异性引物片段人类主
11、要组织兼容性抗原分子特异性引物片段 B1502 荧光荧光分型试剂内容分型试剂内容 本套组提供之试剂量足够提供 48个样本测试使用。 4.1.1 分型反应分型反应管管共共 3 管管(MIX1,MIX2,MIX3): MIX-1,MIX-2,MIX-3 反应管中包含测定 B1502 所需核酸引物及探针。 注:8连管上标记蓝色依序为 MIX1,MIX2,MIX3，另同排空一管后依序为 MIX1,MIX2,MIX3，如下图所示: 4.1.2 主反应液主反应液，每管，每管 150 l，共，共 1 管管 提供聚合酶链锁反应之最适化缓冲液，成分包含 0.18 mM脱氧核苷酸(dNTP)，1.8 mM 氯化镁
12、(MgCl2)，60.3 mM 氯化钾(KCl)，18.9 mM三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)及 0.6% 甘油(glycerol）。 4.1.3 阳性对照阳性对照 ，每管，每管 50 l l，共共 1 管管 作为反应阳性对照。 4.2 4.2 警告及注意事项警告及注意事项 4.2.1 本品仅用于科学研究； 4.2.2 需具有经验和专门培训过的人员进行操作； 4.2.3 PCR操作各阶段应在不同的实验室中进行； 4.2.4 PCR操作每个阶段使用专用的仪器和设备； 4.2.5 使用自卸管(滴头)移液器(加样器)或填塞性滴管(滴 头)； 4.2.6 穿工作服，戴一次性手套； 4.2
13、.7 必须使用一次性吸头，吸完即弃； 4.2.8 用10%次氯酸或70%酒精或紫外线灯处理工作台和加样 器； 4.3 储存条件储存条件 本试剂组在未拆封状态下可于-20oC环境存放 12个月；为避免污染及重复冷冻解冻影响测试正确性，请将 Master 缓冲液依使用习惯进行分装；拆封后未 使用完的分型试剂盘请妥善封存于原包装袋中并置回-20oC，且须于四周内使用完毕。 4.4 使用规范使用规范 分型试剂盘如有破损请勿使用。 5. 设备需求设备需求 5.1 聚合酶链锁反应自动循环控温仪聚合酶链锁反应自动循环控温仪 本套组使用聚合酶链锁反应以 Applied Biosystems Prism 700
14、0/7300/7500进行之标准条件如下，整个反应需时约 50分钟。 聚合酶链锁反应程序设定聚合酶链锁反应程序设定 运行参数： 步骤 循环次数 温度 时间 1 1 96 C 2 分 2 33 94 C 10 秒 65 C (信号采集点) 45 秒 请依各型号之自动循环控温仪操作手册进行程序设定 荧光信号采集点设定在 65 荧光信号采集波长设定 FAM(520nm)和 HEX (560nm) 荧光阀值: FAM 5.0+03e HEX 1.0+03e 荧光仪基线参考值 520。 6. 样本收集及前处理样本收集及前处理 6.1 血液样本采集血液样本采集 血液样本可以含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium
15、 citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以肝素(Heparin)为抗凝血剂采集之样本会干扰后续之聚合 酶链锁反应故不建议使用，样本储存与安定性请参照采血管说明书。 6.2 核酸样本萃取核酸样本萃取 可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量与质量合格的核酸以进行聚合酶链锁反应 。 6.3 核酸样本定量核酸样本定量 提取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如 TE Buffer)之中，且浓度应介于 10-20 ng/l，不可将核酸样本溶解于含有超过 0.5 mM 螯化物如 乙二胺四乙酸(EDTA)之溶液。 6.4 核酸样本质
16、量规范核酸样本质量规范 核酸样本 A260/A280比值应介于 1.65 到 1.8之间。 7. 操作说明操作说明 7.1 套组包含对象套组包含对象 见4.试剂部分 7.2 套组未包含之必需使用对象套组未包含之必需使用对象 7.2.1 聚合酶链锁反应聚合酶链锁反应 7.2.1.1 Taq 核酸聚合酶(DNA polymerase,5 U/l) (建议 Fermentas, Cat. #EP0401 or EP0402) 7.2.1.2 蒸馏水或核酸稀释液(TE Buffer) 7.2.1.3 可调式微量分注器(pipette) 7.2.1.4 抛弃式微量分注器管尖(tip) 7.2.1.5 震荡混合器(Vortex) 7.2.1.6 桌上型离心机 7.2.1.7 荧光 PCR仪 Appli
