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1、上海交通大学硕士学位论文一种内切木聚糖酶的亲和纯化及性质研究姓名：张小勇申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：李荣秀20080101一种内切木聚糖酶的亲和纯化及性质研究 iv一种内切木聚糖酶的亲和纯化及性质研究 摘 要 生物质精炼是绿色化工原料和生物燃料的关键途径之一。 生物质中纤维素和半纤维素的高效降解是生物质燃料生产得以实现的前提条件。 多种纤维素酶和半纤维素酶在生物质的降解过程中发挥着极其重要的作用。 目前对各种纤维素酶和半纤维素酶的组成和催化性质研究还不够深入， 因此纯化和鉴定纤维素酶和半纤维素酶各种组分有着非常重要的理论和生产意义。 内切木聚糖酶是半纤维素生物降解过程
2、中发挥主要作用的酶，目前对其的研究还不够深入。纯化获得该酶的纯酶可以开展广泛的后续研究，因而具有重大意义。 本文利用实验室积累的亲和层析介质库对市售纤维素酶HDL160粗品进行筛选，通过 SDS-PAGE 分析洗脱液的蛋白组成和对CMC-Na、Avicel PH105 等底物的降解活力，初步筛选出对一个蛋白纯化效果较高的亲和层析介质 A83-82。然后在 20ml 亲和层析柱上进行 NaCl 盐梯度和 pH 梯度对市售纤维素酶 HDL160 的纯化效果优化。最终确定了 NaCl 浓度为 0.6M 时为最佳洗脱条件。制备的蛋白，SDS-PAGE 纯度达单一条带，分子量 19.3kDa 左右。经质
3、谱MALDI-TOF-TOF 分析，蛋白鉴定为内切-1,4-D-木聚糖酶。最适底物为木聚糖，还能作用于 CMC-Na、Avicel PH105、低聚木糖、棉花纤维等。以木聚糖为底物时最适温度为 55，最适 pH 为 4.6。目标上海交通大学 硕士学位论文 v酶蛋白还能够作用于天然生物质，诸如稻草粉、麦草粉、竹子粉以及玉米秆粉等。此外初步实验还表明纳米 SiO2、SnO2对目标蛋白的催活活力有明显的促进作用； 该目标蛋白对商品化纤维素酶制剂的催化活力有一定的促进作用，显示出彼此的协同效应。 关键词：纤维素酶 HDL160，亲和层析，A83-82，内切-1,4-D-木聚糖酶，协同效性 一种内切木聚
4、糖酶的亲和纯化及性质研究 viAFFINITY PURIFICATION AND CHARACTERIZATIONS 0F AN ENDOXYLANASE ABSTRACT Cellulase and semicellulase decoding characterization was important to develop efficient lignocellulose lysis catalyst, which is crucial for biomass refinery. A Commercial cellulase Fibrilase HDL160 from Iogen cor
5、poration of Canada was screened against a affinity matrix library of Hundreds species. The SDS and CMC-Na, Avicel PH105 lysis analysis of the elution samples of the initial screen lead to the selection of affinity medium A83-82. The optimization of NaCl concentration and pH on binding and elution of
6、 protein on a 20ml column of medium A83-82, found that at 0.6M NaCl, a protein was purified to SDS-PAGE single band of MW. 19.3kDa. This purified protein was characterized with MALDI-TOF-TOF, and found to be an endoxylanase from Hypocrea jecorina. It acted on Xylan, CMC-Na, Avicel PH105, low polymer
7、ic xylose, defatted cotton, 上海交通大学 硕士学位论文 viiquantitative filter paper, etc, and Xylan is its preferred substrate, whose optimal temperature and optimal pH catalysed by it is 55 and 4.6 respectively. Its catalyse activity can be promote by Nano-SiO2 and nano-SnO2 . It can also improve enzymatic acti
8、vity of some commercial cellulase, which showed synergism among them. KEY WORDS ： cellulase HDL160, affinity chromatography, A83-82, endoxylanase, synergism 一种内切木聚糖酶的亲和纯化及性质研究 ii附件四附件四 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成
9、果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：张小勇 日期：2008 年 3 月 17 日 上海交通大学 硕士学位论文 iii附件五附件五 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本
10、授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名：张小勇 指导教师签名：李荣秀 日期：2008 年 3 月 17 日 日期：2008 年 3 月 17 日 上海交通大学 硕士学位论文 1第一章 概述 1.1 木聚糖、木聚糖酶相关知识 1.1.1 引言(Introduction) 木聚糖(xylan)是一种半纤维素(hemicellulose)，同时也是仅次于纤维素(cellulose)的自然界中的第二大天然聚糖1。它们存在于植物细胞的细胞壁以及中间层，涵盖了非常广泛的多种类型的非纤维素类聚糖，是由比例不同的诸如 D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖
11、、D-半乳糖、D-葡糖醛酸以及 D-半乳糖醛酸等单糖及其衍生物通过不同的共价连接方式所构成。 半纤维素的分类和命名是由构成其主链的单糖残基所决定的。 当聚糖主链水解后获得木糖，那么它就是木聚糖；同样地，半纤维素还包括甘露聚糖、阿拉伯聚糖以及半乳聚糖等2-5。在自然界中，木质半纤维素(wood hemicellulose)是很难仅由上述一种聚糖所组成的。通常是由上述几种聚糖通过多种方式连接组合而成，最常见的有葡糖酸木聚糖(glucuronoxylan)、阿葡木聚糖(arabinoglucuronoxylan)、葡甘露聚糖(glucomannan)、阿半乳聚糖(arabinogalactan)以及
12、半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)等6-9。这些聚糖的组成在物种之间各不相同，甚至在同一物种的不同个体之间也是各异的。可见，半纤维素并不是一个容易定义的化学物质， 但是显然它是植物纤维中一种很重要的组成成分， 因为它的存在而赋予了植物纤维各种特殊的性质。 半纤维素主要是由木聚糖组成的， 它们可以通过木聚糖水解酶(xylanolytic enzyme)而得以降解。真菌木聚糖酶(fungal xylanase)有许多商业用途，比如造纸工业、动物饲料行业、面包制作、饮料和酿酒工业、木糖醇的生产以及生物质燃料乙醇的生产等等10,11。 1.1.2 木聚糖的结构(xylan stru
13、cture) 阿木聚糖存在于小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻谷、高粱、竹子等植物中，它在整个有机体中不是一个很重要的组分，但是却构成了其细胞壁的一个重要成分12。葡木聚糖和葡阿木聚糖主要定位于植物细胞次生壁，它通过与木质素(ligin)、纤维素以及其它的一些高聚物形成共价或者非共价连接而使细胞壁构成一个有机整体。被子植物(angiosperm)的半纤维素主要由木聚糖组成，它占其全部干重的 15-30%；裸子植物(gymnosperm)中的木聚糖含量相对略低，为 7-12%13。 葡糖酸木聚糖主链是由 -D-木糖通过 -1,4 糖苷键共价连接而成。示意图见图 1-1。被子植物(硬木)的葡糖酸木聚糖还有
14、很高的乙酰基取代基(70-80%)，从而赋予其一定的水溶性13。葡糖酸阿木聚糖(glucuronoarabinoxylan)主要存在于裸子植物(软木)中，其主链也是由木聚糖组成，但是在主链上每隔 10 个 -D-木糖残基就有一个 -阿拉伯树胶酸残基侧链。示意图见图 1-2。在实际应用中葡糖酸木聚糖和葡糖酸阿木聚糖都俗称为木聚糖7、14。 一种内切木聚糖酶的亲和纯化及性质研究 2图 1-1 葡糖酸木聚糖10 Fig 1-1 Molecular structure of glucuronoxylan10 图 1-2 葡糖酸阿木聚糖10 Fig 1-2 Molecular structure of
15、arabinoglucuronoxylan10 1.1.3 木聚糖水解酶复合体(the xylanolytic complex) 木聚糖酶(xylanase)催化木聚糖(xylan)的水解。 这些酶主要是由微生物产生的， 参与植物细胞壁的裂解并与其它有关酶一起水解其中的聚糖(polysaccharide)，另外在诸如大麦等植物种子的萌发过程中水解木聚糖为其生长提高碳源和能源。到目前为止还在海藻(marine al-gae)、原生动物(protozoan)、甲壳类动物(crustacean)、昆虫(insect)、蜗牛(snail)以及陆生植物的种子(seeds of land plants)中发现了木聚糖酶7。在所有这些木聚糖酶的微生物来源中，人们最感兴趣的是丝状真菌，诸如木霉、曲霉、青霉、镰刀酶等等。它们可以将这些酶分泌到其周围的胞外培养液中， 同时它们的木聚糖酶活性通常要比来自于酵母和细菌的酶活力要高得多， 实际应用价值很高。 不同来源的木聚糖酶基因也已经分离出来并已经在大肠杆菌中进行了表达。 细菌木聚糖酶不仅酶活力低而且产生的酶主要是在胞内或者外周基质， 在大肠杆菌中表达时也很难进行诸如糖基化等翻译后修饰
