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1、硕士学位论文M A S T E R ST H E S I Sm I I III I I q l ll lLIqllI I I I II i l l l1111 18 9 8 7 0 2华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者签名：骆蜗日期：? , o i l 年- 6 月f 日学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解华
2、中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。作者签名：凳蛹 日期：加J 1 年6 月f 日导师签名：E l 期：伽f 阵6 月豸E l本人已经认真阅读“C A L I S 高校学位论文全文数据库发布章程”，同
3、意将本人的学位论文提交“C A L I S 高校学位论文全文数据库“ 中全文发布，并可按“章程“ 中的规定享受相关权益。作者签名：臻日期：劢f J 年6 月1 日日期：牌月日硕士学位论文M A S T E R ST H E S I $摘要促分裂原激活蛋白激酶( M A P K ) 是细胞内重要的信号分子，它是以蛋白磷酸化的形式将细胞外的刺激信号传递到细胞内，同时特异性地放大信号，并引起细胞反应的一类酶蛋白信号系统。M A P K 级联系统具有高度的保守性，包括3 种蛋白激酶：即M A P T G T T C A G T G A C A A T G G C G A l T G T G T r A
4、 T G G T C C T T C A A G G C C A A T T C T T G G G G A G C T C T C A T G C C A A A G T T C T r G T A C G G G G G A T C C T G T r r C T AAA T C A C C C T C T C T T G A G C T C A C T A T A G G G C A C G C G T G G T C G G o G G A T C C T T C T AAA 1 A C C C T C r 几 G C r 啪A T C C A T G G A J 眦T G A n C
5、 A T G G A G G G G G A G C T C T F A T AA AA r r 】r C A T C A G G C T G A A A G G A G G A G G A G G A A T G G T I G G A C A A A A C A C A C A T A A A C A T C C A A A G T G AAA T C A C A G C A C T T G C A C Cq 5 A A G C C T _ 1 1 A T C T T G A G A G C 1 0 0 ) ，“ ，表示有极显著差异( Pv a l u e O o i ) ，所有实验重复三
6、次。A t m k k l ( S A L K是拟南芥的插入突变体，其插_015914)A t M K K lT - D N AT - D N A在该基因的5 U T R 区，研究发现拟南芥A t m k k l 突变体相对W T 对A B A 不敏感，并且经A B A 处理后A t m k k l 中的H 2 0 2 含量及A t C A T l 的表达量明显比W T 中下降，而在拟南芥中A t M A P K 6 处于A t M K K l 的下游，并且A t M A P K 6 蛋白受A t M K K l 的激活，是d o w n s t r e a m 表达，在我们的研究中，发现G
7、h M A P K 6 与A t M A P K 6 蛋白的氨基酸同源性非常高，其氨基酸一致性高达8 8 ，并且G h M A P K 6 也含有与A t M A P K 6 一致的保守结构域与磷酸化基序。因此我们选择以A t m 触，突变体为实验对象，将G h M A P K 6 回转A t m k k l ，分别从H 2 0 2 含量，A t C A T l 的表达量以及对A B A的敏感性等方面进行相关遗传回复分析。实验结果显示，在正常的环境下，4 2孙靳船衢协oC1c薹嚣霉口ol享o硕士学位论文M A S T E R ST H E S I SG h M A P K 6 一O E 、野生
8、型和A t m 船_ f 突变体，无论是在萌发，幼苗的生长还是成熟植株的生长发育，都无明显的表型变化。在萌发率实验中，在正常的M S 培养基上统计，W T ，A t m k k l 突变体和两个过量表达转基因拟南芥的萌发率并没有差异( 图3 2 0 A ) ；当我们用0 5l aM A B A 处理的时候，G h M A P K 6 O E 的萌发率明显比A t m k k l突变体要迟缓( 图3 - 2 0 B ) ，例如，在萌发1 5 天时，A t m k k l 突变体的萌发率已接近6 0 ，而转基因的萌发率还不到2 0 ，A t m k k l 突变体多数都为长出真叶的绿苗，而G h
9、M A P K 6 O E 转基因l i n e s 大半是微黄色，长出真叶的绿苗很少( 图3 - 2 0 C ) 。所以从萌发率和绿苗率的统计实验证实：G h M A P K 6 O E 转基因拟南芥增强了对A B A 处理的敏感性，能恢复A t m k k l 对A B A 不敏感的表型。ABCD嫩c 觚气A 龌C 丁2A f C A 7A 执C 丁2+ A B A堡黑熊。，爹一A B A滋7 7 了j孳 u ，、f 暂j ，“，图3 - 2 1G h M A P K 6 过量表达转基因拟南芥中A t C A T l 的表达量及H 2 0 2 含量为了检测G h M A P K 6 过量表
10、达转基因拟南芥中A t C A T l 的表达量及H 2 0 2 含量，先将G h M A P K 6 过量表达转基因两个l i n e s ，A t m k k l 突变体及野生型的种子在M S 培4 3露鬻硕士学位论文M A S T E R ST H E S l 8养基上生长两周，然后将两个过量表达转基因l i n e s ，A t m k k l 突变体及野生型拟南芥小苗移至M S 液体培养基以及含1 0 0uM A B A 的M S 液体培养基中生长5 h ，提取总R N A ，逆转录为e D N A 后，做半定量R T P C R 分析，如图3 2 lA 在正常条件下彳f 翻”在W
11、T ，A t m k k l 及两个C 玩弛4 P K 6 过量表达转基因拟南芥l i n e s 中表达量很低且没什么变化，但是经1 0 0uM A B A 处理后，虽然A t m k k j 突变体中4 f C 4 丌的表达量很低，而在W T ，G h M A P K 6 过量表达转基因拟南芥中A t C A T l 的表达量则明显高于A t m k k l突变体( 3 2 1B ) ，说明G h M A P K 6 - O E 转基因拟南芥恢复了A t m k k l 突变体中A t C A T l的表达量，即能恢复A t m k k l 的缺陷。活性氧( r e a c t i v e
12、o x y g e ns p e c i e s ，R O S ) ，如超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、羟自由基( O H )和过氧化氢( H 2 0 2 ) 均是植物尤其是高等植物在有氧代谢过程中产生的，植物组织受到环境胁迫时大量富集【7 7 , 7 8 】。一般认为H 2 0 2 是植物体内产生的最稳定的活性氧分子，它可以直接或间接地导致细胞膜脂的过氧化伤害，加速细胞的衰老和解体。H 2 0 2是氧化进程中的主要产物之一，我们改用组织化学的方法，9 - - 氨基联苯胺( D A B )组织化学染色法检测植株或组织内H 2 0 2 的积聚。此技术的优势之处在于具有组织特异性，D A B
13、在过氧化物酶( P O D ) 参与下与H 2 0 2 在H 2 0 2 产生的部位发生反应而 形成红褐色聚合物( D A B + P O D + H 2 0 2 一D A B - H 2 0 2p o l y m e r s ) 。因此，用D A B 染色可以检测植物受到环境胁迫时是否有H 2 0 2 积累，同时根据观察所产生斑点的多寡，还可以初步估算H 2 0 2 的积累量【7 9 s 们。图3 2 1D 中，在正常条件下H 2 0 2 在W T ，A t m k k l 及G 矗 纠尸肠过量表达转基因拟南芥中表达量很低并且没什么变化，但是经1 0 0 | lM A B A 处理后，A t
14、 m k k l 突变体中H 2 0 2 的表达量依然很低，而在W T ，两个G h M A P K 6 过量表达转基因拟南芥l i n e s 中H 2 0 2 的表达量则明显高于A t m k k l 突变体( 3 - 2 1C ) 。该实验说明G h M A P K 6 O E 转基因拟南芥恢复了A t m k k l 中H 2 0 2 的含量， 即能恢复A t m 船，的缺陷。由以上实验推测删尸肠可能与彳m 纠尸膨的功能类似，可能也参与了A B A 诱导的C A T l 的表达及H 2 0 2 的含量。硕士学位论文M A S T E R ST H E S l S四、讨论4 1 棉花G
15、h M A P K 6 基因及其编码蛋白结构同源性及进化分析研究基因的外显子内含子的数目、长度和位置可以为基因在进化方面提供依 据。从棉花根c D N A 文库中分离得到了一个G h M A P K 基因( G h M A 尸肠) ，对G h M A P K 6 基因的D N A 全长序列进行分析，其全长序列含有6 个外显子和5 个内含子，与A 类M A P K 中的A t M A P K 6 基因的D N A 全长序列相比较，其内含子的数目、长度和插入位点上相似，说明了该类基因在进化中的保守性。但和棉花中分离到的 其他M A P K 基因相比较有很大差异。如：已报道的两个C 类M A P K
16、 基因，删联和G h M A P K 7 基因的D N A 全长序列含有3 个外显子和2 个内含子1 7 2 , 7 3 】，推测同一类M A P K 可能在进化中具有相对保守性。 对G 乃砌P K 6 所编码蛋白的结构做了相关分析，G h M A P K 6 与A 类的 A t M A P K 6 、N t S I P K 、N b S I P K 处在同一进化枝上，说明G K 6 属于A 类M A P K蛋白，研究发现A 类M A P K s 主要响应环境以及与激素有关的一些事件，如拟南芥中的M P K 3 受一些环境胁迫所激活【9 】，并且在活性氧的刺激下也可以被激活【1 0 】；另外与M P K 3 同源性比较高的烟草中的W I P K 参与伤诱导的信号转导【l l 】，一些生物以及非生物胁迫也可以激活烟草中的S I P K t l 2 】。A t S I P K 可被损伤、盐、渗透压和病原物衍生的激发子所诱导1 8 1
