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1、兼性嗜热古地分枝杆菌燃料油脱有机硫研究硫源 进行生长， 如4 一 甲 基D B T ( 4 - M e t h y l - D B T , 4 - M - D B T ) 和4 , 6 一 二甲 基D B T( 4 , 6 - D i m e t h y I D B T , 4 , 6 - D M - D B T ) 。 通过H P L C , G C , G C / M S 分析， 菌株可以降解D B T衍生物。 菌株X 7 B代谢4 - M - D B T ， 不仅4 - M - D B T 的苯环加上了 轻基，而且含 有 甲基取代 的苯环也加 上 了轻 基。生成 了 2 - 轻基一 3
2、一 甲基联 苯( 2 -h y d r o x y - 3 -m e th y lb ip h e n y l ) 和 2 - T 3 基 一 3 一 甲 基联 苯. 菌 株降 解 含有甲 基 的D B T ，生成了含有甲基的 2 - 经基联苯，说明菌株 X 7 B可以专一性的作用于4 - M - D B T ， 推测其途径基本符合 “ 4 S ” 脱 硫途 径。 X 7 B代谢 4 , 6 - D M - D B T的途径也类似于D B T的降解， 即得到的单轻基二甲基 D B T的轻基也被甲基化了， 生成了2 一 甲 氧 基 一 3 ,3 一 二 甲 基 联 苯 ( 2 -m e th o
3、 x y - 3 ,3 - d im e t h y l-b ip h e n y l ) 。 这 进一 步验 证了 菌 株X 7 B “ 4 S M ” 脱 硫 途 径。 该 结 果 表 明 ， 菌 株X 7 B 的 脱 硫 酶 系 不 同 于以前报道的菌株。同时，使用 G i b b s试剂法，检测到菌株降解苯并唾吩( B e n z o t h i p h e n e , B T H ) 生 成了 带有经基的 物质， 说明 菌株X 7 B也可以 降解B T H .由上述结果可以知道，菌株在脱硫过程中，对于 D B T衍生物，其脱硫的速率，脱硫的专一性，受到取代基团类型及其位置的影响。使用
4、脉冲场电泳，质粒提取，S o u r t h e rn 杂交技术，验证菌株脱硫性状是由一个大质粒控制的。 根据已经发表的脱硫基因序列的保守性，设计了引物， 使用聚合酶链式反应 ( P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n , P C R ) 扩增了古 地分枝杆菌X 7 B的脱硫基因， 连接到P U C M 一载体上， 并 转化到E . c o l i D H 5 a 中 进行表达。 克隆的d s z C的重组子具有对D B T的加氧 作用能 力， 生成D B T 0 2 ， 基因 测序结果表明，X 7 B菌株的d s z C基因序列和己经发表的
5、红球菌的 以不同硫源，如二甲 基亚讽 ( D i m e t h y l s u l f o x i d e , D M S O ) , N a 2 S 0 4 , D B T 培养的种子， 接种于含有多种不同硫源 ( 0 .5 m M)的培养基，结果表明菌株 X 7 B对不同硫源均有较高的降解活力，尤其对于单唾吩类物质，降解率一般都较高，可达 1 0 0 %。对于甲山东大学博士学位论文基化的D B T , B T H ， 实验结果表明， 降解比 起单唾吩系列 的要难。以D M S O作为硫源培养的种子， 接种于多种硫源时， 菌株生长的延迟期较短， 对于多种硫源降解效果相对较好。菌株 X 7
6、B的休止细胞可以在 1 2 h内降解 0 . 5 m M 的4 , 6 - D M- D B T , 0 . 3 5 mM的4 - M - D B T ; 在4 h内 ， 可以降 解。 . 5 m m的5 - M - B T H ， 说明该 菌株具有很宽 的底物作用范围 和较快的 脱硫反应 速率， 在燃料油脱硫中具 有很大的 潜力。在室温下制备的 菌株X 7 B 的生 物脱硫催化剂脱硫活力 半衰期 是3 2 d ， 而对照 菌 株R . e ry th r o p o lis I G T S 8 仅 为7 d 左 右 。 X 7 B 菌 株 表 现出 较 好 的 稳 定 性 和 高效性， 显示
7、了 其在B D S 中的 应用潜力。优化了 古地分枝杆菌 X 7 B生 物脱硫催化剂的制备条 件，以 便应用于模拟油相和燃油实 际脱硫。 摇瓶分批实 验数据表明， 葡萄糖 和甘油 是菌株 X 7 B最适合的 碳源和能源， 使用葡萄糖， 其 最佳初始浓度为巧g / 1 。 最佳的 氮源是硝酸按，合 适的 初 始 浓 度 为1 动。 实 验 还 表 明 初 始P H 为7 .5 时 ， 菌 株 生 长 最 佳。 底 物D B T对菌株生长有抑制作用，当D B T 浓度为0 . 2 m M时， 得到最大的菌体 浓度，当提高D B T 浓度至5 m M时， 菌体生 长受到了 抑制。 检测了 产物2 -
8、 H B P , 2 - M B P对菌体生长和脱硫的影响，当培养基中2 - H B P达到 1 m m 以上，基本上抑制了菌株的 生长和脱硫， 2 - M B P 相比2 - H B P 对菌株生 长和脱硫的影响 要小一点。催化剂的制备， 可以使用D B T为唯一硫源，但由于 D B T价格昂贵，因此脱硫工业中直接使用 D B T ，投资过大。为了尽量的减少催化剂生产的成本，有必要选择替代物来代替D B T 。 选 用D M S O来制备生 物催化剂，不仅价格 低廉，而且脱硫活力和 D B T培养的细胞的脱硫活力相当。使用计算机控制的全 自 动发酵罐， 优化了 生物脱 硫催化剂的 制备条件。
9、 通过流 加浓缩的营养元素， 调节 搅拌 转速和通气比， 提高了 菌株生长的 浓度。 在2 升发酵罐中， 以0 . 5 m M D B T为 唯一硫源， 培养的菌体 浓度达到了5 . 4 克 / 升细 胞干重， 并具有较高的 脱硫活 力。 使用D MS O培养，菌株也具有较佳的脱硫活力。在 5升发酵罐中，培养菌株 X 7 B ,得到5 . 0 克 / 升细胞干重浓度的菌 体， 同 时检测脱硫活力 表明， 在对数期中 期收集的菌体脱硫活力高，适合于进一步的实验需要。使用生 物脱硫催化剂， 进行了 模拟油及燃油的 脱硫实验。 柴 油中的 不稳定 因素比较多， 给生物脱硫的理论研究带来了困难， 模拟
10、油相反应因为易于检测控制，兼性嗜热古地分枝杆菌燃料汕脱有机硫研究所以首先使用模拟油相反应来摸索燃油脱硫条件。用正十四烷来代表柴油烷烃，使用 D B T作为有机硫的代表。 结果表明正十四烷既能提高 D B T在细胞内外的传质速率，同时也能溶解 2 - H B P , 减少了底物和产物对于脱硫的抑制， 大大地提高了 菌株的 脱硫活力。实 验结 果表明，可以 在2 1 h 内， 将含有4 . 8 m M D B T 的正十四 烷的 模 拟油 ( 相当 于2 0 0 p p m S ) ， 含 硫 量 降 至3 2 p p m ， 脱 除 率 为8 4 % .研究了脱硫过程中加入表面活性剂对于脱硫的影
11、响， 有意思的是， 加入的表面活性剂对于菌 株X 7 B 效果 不明 显， 说明菌株X 7 B 可能自 身产生了 表面活性剂。初步试验表明，菌株 X 7 B确实产生了表面活性剂，促进了脱硫。在上述试验基础上， 同 时将制备的 生物脱硫催化剂应用于加氢精制 柴油的 脱硫实验表明， 菌株X 7 B 可以 在 较高的 温度条件下脱硫; 能够将 含硫量为2 0 5 p p m的 硫降 至1 9 . 8 p p m， 脱除率为9 0 % : 将一 种含硫量为5 3 5 p p m的柴油降至7 2 p p m ,脱除率为 8 6 %. G C - F I D和 G C - A E D分析表明，生物脱硫催化
12、剂作用后， 燃油烷烃没有显著的 变化， 含硫有机 化合物， 除了 一些烷烃取 代基较长的外， 基本脱除千净。 这说明 菌株X 7 B具有 极大的 应用潜力。关键词:二苯并噬吩;生物脱硫;古地分枝杆菌;兼性嗜热菌;燃料油山东大学博士学位论文ABS TRACTD i b e n z o th i o p h e n e ( D B T ) i s t h e m o s t e x c e s s i v e s u l f u r c o m p o u n d i n f o s s i l f u e l sa n d i s r e fr a c t o ry t o e l im i n
13、 a t e u s i n g c o n v e n t i o n a l h y d r o d e s u l f u r i z a t i o n ( H D S ) ,t h e r e f o r e , D B T i s w i d e l y r e c o g n i z e d a s t h e m o d e l c o m p o u n d f o r m i c r o b i a ld e s u l f u r i z a t i o n . T h e m e t h o d s f o r r e m o v i n g D B 工u s i n
14、g b a c t e r i a , w e r e t w o f o l d : t h ef i r s t o n e i n v o l v e s t h e d e s t r u c t i o n o f t h e c a r b o n s k e l e t o n , re s u l t i n g i n f o s s i l f u e l sc a l o r i c v a l u e r e d u c t i o n ; t h e s e c o n d , t h e u s e o f a s u l f u r - s p e c i f i
15、 c p ro c e s s o fb i o d e s u l f u r i z a t i o n , w i t h o u t c l e a v i n g t h e c a r b o n r i n g . B e c a u s e t h e s e c o n d m e t h o d d o e sn o t d e g r a d e t h e v a l u e , o f t h e f u e l , i t i s c o n s i d e r e d b y m o s t re s e a r c h e r s t o b e t h e m
16、 e t h o do f c h o i c e . T h e s u l f u r s p e c i f i c p a t h w a y i s u s u a l l y c a l l e d 4 S p a t h w a y d u e t o i t s f o u rs u l f u r c o m p o u n d s m e t a b o l i t e s d u r i n g D B T d e g r a d a t i o n . A b a c t e r i u m , d e s i g n a t e d X 7 B ,w a s o b t a i n e d f r o m s o i l c o l l e c t e d f r o m a f i e ld t h a t c o n t a i n e d w a s t e wa t e r f r o m ar e f i n e ry . I t w as c o n f i r m e d t h a t X 7 13 c o u l d
