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1、山东大学硕士学位论文A AA A Ak K 吒G G FG G GH P L Ck 1 ) aP A G EP B SP C 乙P 船P L AS D ST L C4缩写词表a m i n oa c i d 氨基酸N s u c c i n y l A l a A l a A l a p n i t r o a n i l i d eN - s u c c i n y l A l a A l a P r 舻P h e p n i t r o a n i l i d eN - s u c c i n y l - G l y - G l y P h e - P n i t r o a n i l
2、i d eN - s u c c i n y l G l y G l y G l y p - n i t r o a n i l i d eH i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y 高效液相K i l l o D a l t o n 予道尔顿P o l y a c r y l a m i d eG e lE l e c t r o p h o r e s i s 聚焉烯酸胺凝胶电泳p o l y ( b u t y l e n es u c c i n a t e ) 聚丁烯琥珀酸酯p o l y (
3、酸性溶液 中性溶液。聚乳酸不同酌结晶性也导致了其降解性的差异。般来说，非结晶态懿P D L A 比结晶态的P L L A 更容易加水降解。P D L A材料在生理盐水中降解，相对分子质量半衰期为3 星期至1 0 星期，而P L L A 则至少为2 0 个星期。据报道，半结晶态的P L l 。A 降解存在着两个阶段，第个阶段，水分子扩散到聚乳酸的无定型区域，导致酯键随机断开。随着降解的进行，当无定型区域降解几乎结束时，结晶度增加。在第二个阶段，水解才由结晶区边缘向结晶中心开始降解。在无定型区水解过程中，生成立构规整的低分子物质，结菇度增大，延缓了进一步东解的进行。这一性能被用于骨修复和骨内固定材
4、料中，调节材料的降解速度以满足人体对材料的要求。酶催化水解、微生物降解是可降解材料在自然界中最普遍存在的降解方式，聚乳酸可以被微生物降解。通过生物降解试验，即模拟材料在自然环境中加速降解的试验方法，研究了聚乳酸在活性污泥，室外土埋条件下的降解速度，发现在微生物含量较多的活性淤泥中的降解速度快，这是因为微生物能分泌使聚乳酸降解的酶。1 3 1 聚乳酸降解菌株自然界中已知能够降解聚乳酸的微生物是十分有限的，N i s h i d a 和P r a n a m u d a等人利用平板透明圈计数法，对不同土壤环境中能够降解聚酯的微生物情况进行了测评。结果显示，自然界中能够降解聚羟基丁酸酯( P H B
5、 ) ，聚己内酯( P C L )的微生物数量是基本相似的，大约在O 8 。1 1 ，而降解P L A 的微生物数量还不到0 0 4 。土壤掩埋的对照实验也显示如，P L A 在土壤中的降解速度相对比较缓慢，一般要在一年以上。1 9 9 6 年A T o r r e s 等人报道了F u s a r i u m m o r t Y I i f o r m e能够吸收D L - - * L 酸和部分可溶的寡聚物，并能在共聚物上生长。毽这种作熏十分缓慢，并且必须以自然条件下寡聚物自身的大量水解为前提。1 9 9 7 年P r a n a m u d a 筛选到了一株能够高效降解p L A 的微生物
6、菌株_ 爿朋弦D 肠鲫灯心H T - 3 2 ，经过1 4 天的液体培养能够使6 0 的P L A 薄膜发生降解，这是关于P L A降解菌株的首次报道。目前，人们从自然环境中和已经建立的菌株库当中，分离到了大约几十种能山尔大学硕士学位论文够降解P L A 的菌株，这些降解菌株大部分部属于放线菌，例如爿厦粥。扬印s 如属菌株，K i b d e l o s p o r a n g i u ma r i d u m 和S a c c h a r ot h r i xw a v w a v a n d e n s i s 等。在2 5 株A m y c o l a t o p s i s 属的菌株中
7、，有1 5 株能够在P L A 乳化平板上形成明显的透明圈。鉴于这些菌株都属于稀有放线菌，人们对菌种库4 1 个属的1 0 5 株放线菌进行检测，并进行了1 6 Sr R N A 序列分析，结果显示P L A 降解菌在系统发生上属于P s e u d o n o c a r d i a c e a e 家族以及其相关属，包括A m v c o l at o p s i s ，L e nt z e a ，K i b d e l o s p o r a n g i u m ，S t r e p t o a l o t e i c h u s 和S a c c h a r o t h r i x 。
8、据此，入们推测P s e u d o n o c a r d i a c e a e 家族以及其相关属可能在自然界的聚乳酸降解中起着重要作用。此外，还分离到少数能够降解P L A 的细菌，以及唯一株具降解活力的真菌7 “t i r a c h i u ma l b u m 。加t i r a c h i u ma l b u m 在加入0 1 明胶诱导物的液体培养基中，经过1 4 天培养可以使7 6 的P E A 薄膜发生降解。已有的结果显示，上述相关微生物的P L A 降解能力与它们可以分泌产生某类特殊的蛋白酶相关。同时，研究还发现大多P L A 降解菌株能够吸收降解产物乳酸，但也发现有些菌
9、株并不能吸收乳酸，因此会在培养基中造成产物的积累。1 3 2 聚乳酸降解酶类1 9 8 1 年，W i l l i a m s 首次报道了来源予T r i t i r a c h i u ma l b u m 的蛋白酶 ( 对聚乳酸具有降解作用。此后，蛋囱酶K 一直作为一种公认的P L A 降解酶来研究P L A 及其混合物的降解特性。T s u j i 等人研究了蛋白酶K 对P L A 无定型区和结晶区的降解情况，结果显示，无定型区要比结晶区的酶解速率快。鉴于蛋白酶K 对P L A 的降解作用，O d a 等人对5 6 种商业蛋白酶进行了检测，结果发现酸性和中性蛋白酶基本上都不能降解P L
10、A ，丽些来源予细菌的碱性蛋白酶剐对P L A 有骧显的降解作用。对这些蛋白酶的迸步研究表明，有降解作用翡酶均属予丝氨酸蛋蛊酶家族，焉且对角蛋自都有降解作用，但并非所有能够降解角簧自的酶都能够降解p L A ，这种结果显示出P L A 和角蛋白的酶解存在一定的相关性，但又存在着一定的差别。对丝氮酸蛋白酶酶解各种聚酯结果显示，蛋白酶K ，枯草杆菌蛋白酶，Q 一胰凝乳蛋白酶以及弹性蛋白酶和胰岛索都能够在定程度上降解P L A ，但降解能力逐渐减弱，而且丝氨酸蛋自酶抑制剂能够强烈抑制这些蛋白酶的P L A 降1 0出衷大学硬士学蓥论文解活性。因此，可以推测这些酶对P 乙A 的降解机制可能与降解簧白的
11、机制是相同的，但E D T A 和表面活性赛U p l y s u r f 对酶解P L A 也有很强的抑制作焉，这说明蛋白酶对P L A 的降解可能还有其独特性。因为脂肪酶能够随机地切断聚醮主链的酯键，在脂肪族聚酯Y X I P C L 的降解中起重要作用，而P L A 属于脂肪族聚酯，其单体乳酸之间是靠酯键进行连接的，因此从理论上讲，脂肪酶应该对P L A 具有降解作用，但对1 8 种商业脂肪酶的研究结果却表明，虽然大部分脂肪酶对P C L ，P B S 等都呈现较好的活性，但只有一种来源于A l c a l i g e n e ss p 的脂肪酶在5 5 滞8 5 的条件下，经过2 0
12、天可以实现对P I A 的完全降解。推测这静酶的降解是以高温和高p H 豹水解为基础，对P I A水鳃的中闻产物乳酸寡聚物的降解起主要作用。有人推测，脂肪酶能够降解各种低T m ，没有手性碳原子，在酯键和酯键之间具有大量亚甲基基团的无定型聚合物，而不能水解具有典型手性碳的聚酯例如P H B 和P L A 。但2 0 0 3 年A k u t s u S h i g e n o 等人采用分子生物学的方法进行功能筛选，克隆了P a e n i b a c l l l u sa m y l o l y t i c u sT B - 1 3 的一个P L A 降解酶基因，并在最c o l l 中实现7
13、 功能性表达。这个降解酶分子量在2 2 k D a 左右，底物特异性较宽，对脂肪酶底物和许多生物聚醺都有降解作用。经过序列比对发现P l a A 的氨基酸序列与杆菌脂肪酶的同源性不到4 5 一5 0 ，但1 0 7 位到1 1 l 位的氨基酸残基A l a 一S e r _ G 1 y 却是作为细菌脂肪酶保守性五肽而存在的，系统发生分析显示出P l a k 与细菌脂肪酶家族f a m il yI - 4 具有序列相似性，但与此家族中的其它酶同源性不高，因此成为f a m i l yI - 4 中一个独立的分支，它的许多功能特性与典型的f a m i l y 王q 脂肪酶有着嗡显不同。随着高效P
14、 L A 降解菌株的发现，P L A 降解酶昀研究也取得很大进展。N a k a m u r a 等人从A m y c o l a t o p s i ss t r a i nK 1 0 4 1 中纯化到了一个P L A 降解酶组分，分子量为2 4 k D a ，酶反应的最适温度和p H 分别为5 5 6 0 和p H 9 5 。它除了对P L A 具有酶解作用以外，对酪蛋白和纤维蛋白都有降解作用，因此推测其为丝氨酸型蛋白酶。同年，P r a n a m u d a 等人也报道了) 叭A m y c o l a t o p s i ss t r a i n 4 1 分离获得了一个降解酶组分，其
15、分子量为4 0 k D a ，反应的最适温度和p H 分别为3 7 4 5 。C 藕p H 6 ，对酪蛋自和纤维蛋白也有降解作瘸。从底物特异性上分析，这两类降解酶可能属于蛋白酶家族，但荚精确的作雳机制仍不清楚。此外M a e d a 等出家大学谚! 士学位论文鼬删獭。移, z a e 菌株的发酵液中分离到了一分子量为2 1 6k D a 的P B S 降解酶，氨基酸序到比对分橱推断是一种角质酶，丽这种蕉质酶对P L A 也有一定的降解作用。M a s a k i 等人也报道了来源于酵f 蕈C r y p t o c o c c u ss p S t 商nS - 2 的一神类似子角质酶的降解酶对
16、P L A 等生物聚醚都有相对高效的降解作用。这些新型降解酶的发现无疑为P L A 降解酶的研究以及降解机制的阐明提供了新的信息。下表总结了近年来发现的P L A 降解菌株及其产生的降解酶的相关信息。表1 懿型的P L A 降解微生物及其降解酶近来，M a t s u d a 等人获得了A m y c o l a t o p s i ss t r a i nK 0 4 - 1 编码P L A 降解酶的基因P l d ，并在S t r e p t o m y c e sl i v i d a n s1 3 2 6 中进行了表达，其表达需要N 端3 5个氨基酸，包括2 6 个氨基酸的信号肽和9 个氨基酸的前残基，从而产生2 0 ，出哀大学硬士擎建论文9 0 4 D a 的成熟酶，其中前序列的切除是自催化的。P L D 显示滋与许多真核生物丝氨酸蛋白酶4 5 的相似性，而且它具备丝氨酸蛋自酶编码催化三联体的保守序列，结合其它的保守性分
