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1、原 创 性 声 明本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论 文 作 者 签 名 :了 日 期 :L a a 3 . 1、 了 。关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或
2、其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论 文 作 者 签 4 嘛导 师 签 名 :山东大学博士学位论文中文摘要粘细菌 ( M y x o b a c t e ri a ) 是一类具有复杂多 细胞行为的原核生物， 在细胞的生长、 摄食、 运动和分化发育等方面表现出显著的社会性特征， 是目前原核生物中己 知的 唯 一具 有 多 细 胞 行 为 特性的 类群， 被 认为 是最高 等的 原 核生 物， 是 众多研究方向的著名模式材料。 另一方面， 粘细菌能够合成丰富多样的、 新化合物结构类型的生物活性次级代谢产物，具有巨大药物开发潜力的药源菌类群。因此，粘细菌不但具
3、有重要的 基础研究价值，而且有诱人的应用开发前景。粘细菌以形态学特征为依据可以分为二个亚目，四个科，十二个属，约 3 5个种; 根据对环境营养物利用的生理特性， 粘细菌可以分为两个类群， 溶细菌类群和溶纤维素类群。 其中仅有堆囊菌属是溶纤维类群的。目 前， 除了生物活性化合物筛选和几种聚酮类化合物合成酶基因工作外， 溶纤维素群粘细菌的基础研究几乎为零。 为了更深入地研究和开发溶纤维素粘细菌资源， 本文在溶纤维素群粘细菌的分离纯化、生态分布、系统分子分类、降解纤维素机制进行了 初步 探索.一、溶纤维素粘细菌的分布和分离我们对几种类型的环境样品， 包括1 3 个农田土样、 5 1 个树皮或草样和若
4、干极端环境一 碱性程海湖土样、 海底淤泥、 南极土样和沿海泥沙样中的溶纤维素粘细菌进行了分布研究和菌株分离。 富集分离用C N S T固体培养基和WC X粪粒平板。深海和南极样品在室温孵育的同时，另做平板置于1 0 0 C冰箱中长时间孵育观察: 程 海湖的 样品同 时 在p H 1 0 的 平板 上 孵育 观察: 沿 海 样品 及深 海 样品 同时接种5 0 % 海水培养荃孵育观察。 进一步纯化采用直接纯化、 加热法纯化、 抗生素抑制 杂菌 法进行纯 化 或 抗生 素 诱杀 杂菌法. 溶纤 维素 粘细 菌的 形态 分 类根 据( B e r g e y s M a n u a l o f D
5、e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y ) ( 第九版，1 9 8 9 ) 和 ( T h eP r o k a r y o t e s ) ( 第二 版，1 9 9 2 ) 的 形态分类标准 鉴定， 包括子实体结构、 群落形态、营养细胞形态、粘抱子形态等特征，同时根据纤维素降 解活性判断。在1 3 个农由 土样中 共分离出不同形态的溶纤维素粘细菌菌株或疑似菌株3 1株， 平均每个土样3 . 1 株; 5 1 个树皮朽木或枯败草本样品中 共分离出不同形态的山东大学博士学位论文溶纤维素粘细菌菌株或疑似菌株6 8 株， 平均每个样品1 .3
6、株， 溶纤维素粘细菌的出现随地区和植物的种类不同而有较大的差异;云南丽江程海湖地区1 1 个碱性样品中仅有4 个样品( 三个土样和一个树皮样) 能够出现溶纤维素粘细菌 ( 1 3株)， 包含不耐碱、耐碱和嗜碱的菌株;在1 0 个海洋样品中只分离出2 株溶纤维素粘细菌;在深海样品和南极样品未能发现溶纤维素粘细菌菌株。二、溶纤维素粘细菌的系统分类基于前期对纤维堆囊菌的大量分离和形态学特征， 选择了十株溶纤维素粘细菌进行了1 6 S r D N A序列测定和同源性分析， 并对比讨论了序列同源性和形态学分类结果的异同。营养细胞观察C N S T 平板培养3 天的2 0 0 个细胞计算平均值，子实体在解
7、剖镜下观察，子实体压碎后观察2 0 0 个抱子的平均大小。1 6 S r D N A P C R扩增引物对为5 - A G A G TT T G A T C C T G G C T C A G - 3 ( 1 0 - 3 0 F ) 和 5 - A G A A A G G A GG T G A T C C A G C C - 3 ( 1 5 0 0 R )。三个测序引物为5 - G T A TTA C C G C G G C T GC T G - 3 ( 5 3 6 - 5 1 9 )、5 - A A A C T C A A A G G A A T T G A C G G - 3 ( 1 1
8、1 5 - 1 1 0 0 )和5 - AGG GTT GC G CT C GTT GC G- 3 ( 9 0 7 - 9 2 6 )。纤维堆囊菌的营养细胞和粘抱子在形态上几乎完全相同， 即末端钝园的圆柱形坚硬棒 杆状， 但粘抱子的 大小可以 分成两 个群: 3 - 4 x l - 1 .2 p m和 2 - 3 x l W m 。 粘抱子通常包被在小抱子囊中， 但S o 9 9 8 7 - 5 未发现任何抱子囊结构， 而S o 9 8 8 1 在分离纯化后不久即丢失形成小抱子囊能力。 小抱子囊有两种形态: 多角形的袍子囊较大， 直径 3 0 - 6 0 p m, 抱子囊之间组织松散，并且在抱
9、子囊之间 存在许多胞间 物质: 球形抱子囊较小， 直径约 1 0 - 3 0 p m, 抱子囊更紧实. 小抱子 囊被一层膜包裹而形成有大有小的子实体， 但S o 9 7 2 1 - 1 的小抱子囊是散落在培养基上的，不堆成子实体。 子实体的颜色变化很大， 从黄色， 橙色， 橙棕色， 红棕色， 到深棕色，甚至黑色。十株纤维堆囊菌的 1 6 S r D N A序列在 G e n B a n k中的序列号为:S o 9 8 8 2 - 1( A F 4 6 7 6 7 3 , 1 5 5 5 印) 、 S o 9 7 3 5 - 2 2 ( A F 4 6 7 6 7 5 , 1 5 5 7 b p
10、 ) 、 S o 9 7 3 3 - 1 ( A Y 0 3 9 3 0 4 ,1 5 5 6 b p ) 、 S o 0 0 8 9 - 1 ( A Y 0 7 9 4 5 3 , 1 5 5 2 b p )、 S o 9 7 2 1 一 1 ( A Y 0 3 2 8 8 0 , 1 5 3 7 b p ) 、山东大学博士学位论文S o 9 8 5 7 ( A F 4 6 7 6 7 4 , 1 5 5 5 b p ) , S o 9 8 8 1 ( A F 4 6 7 6 7 2 , 1 5 5 5 b p ) , S o 9 9 8 7 - 5 ( A F 3 8 7 6 2 8 ,1
11、 5 7 6 b p )、 S o c e 2 6 ( A F 3 8 7 6 2 9 , 1 5 5 4 b p ) 和S o 9 7 4 1 ( A F 3 8 7 6 2 7 , 1 5 5 9 b p )。利用P h y l i p s 软件包( v 3 . 6 ) 的D n a d i s t l N e i g h b o r 程序分 析1 6 S r D N A 序列表明，溶纤维素粘细菌不同 菌株的1 6 S r D N A序列高度同源， 序列的最大进化距离小于3 % ( S o 9 7 4 1 与其他菌株之间的差异);1 6 S r D N A序列细区可以分三个亚组，有两个亚组
12、分别只包含一个菌株， 即S o 9 7 4 1 和S o c e 2 6 ， 第三个亚组包含其余的I l 株菌。 溶纤维素粘细菌1 6 S r D N A序列与“ 近源” 的溶细菌群粘细菌，如软骨霉状菌和多囊菌P o ly a n g i u m t h a x e r i 的1 6 S r D N A序列的 进化距离在4 - 8 % ， 而与其他“ 远源” 的粘细菌如小囊菌 N a n n o c y s t i s e x e d e n s ,粘球菌分枝，以及多囊菌P O 加n g i u m v i t e l l i n ， 的进化距离为1 5 - 1 8 %. 不同 粘细菌分枝之间
13、的 进化距离均在1 5 - 1 8 % 之间，不同属之间的距离为4 - 8 %， 属内各种的距离小于3 %a所有的纤维堆囊菌菌株根据 1 6 S r D N A序列的同源性都可以归于一个属内，即 堆 囊菌( S o r a n g iu m ) . 这些溶纤 维素的 粘细菌 不应归 在多 囊菌属( P o ly a n g i u m )中 。 在 P r o k a ry o t e s 中， R e ic h e n b a c h 和D w o r k i n 建 议溶 纤 维 素 粘细 菌 分为 两个种， 一 个是产生黄色至橙色子实体的紧实 堆囊菌 ( S o . c o m p o
14、s i t u m ) ， 另一 个是子实体为 棕色、 灰色或黑色的纤维堆囊菌 ( S o . c e l l u l o s u m )。 我们的研究结果表明， 粘抱子的大小和小饱子囊的形态变化与1 6 S r D N A变化一致的。 根据形态分化的差异和1 6 S r D N A序列的差异， 堆囊菌属划分至少两个种， 其中之一是粘抱子的 大小 在2 - 3 x l l t m之间， 具有球形的小 抱子囊( 直径为1 0 - 3 0 g m ) ， 子实体颜色通常是橙色或棕色， 这个组与建议的紧实堆囊菌种很相似。 第二个种具有较大的 粘饱子 ( 3 - 4 x l p r n ) ， 小 抱
15、子 囊多 角形， 直 径约4 0 - 8 0 1 u n ， 并在小 抱子囊周围存在大量的胞间物质， 子实体颜色通常是棕色到黑色。 该组粘细菌与建议的纤维堆囊菌 ( S . c e l l u l o s u m )很近源。但考虑到1 6 S r D N A序列的差异，这个种可能仍是异源的。三、溶纤维素粘细菌的纤维素酶扫描电镜观察纤维堆囊菌降解纤维素的行为. D N S法测定纤维素各种酶活和木聚糖酶活。P ie r c e公司的B C A总蛋白检测试剂盒测定蛋白含量。纤维素酶复合体 用两步法制 备: 第一步2 0 m M T r i s - H C I b u ff e r ( p H 7 .
16、 5 ) 预洗脱， 第二 步用重蒸水洗脱。 第二步洗脱液过滤、 离心、 冻干。 得冻干酶粉。 酶溶液用S e p h a r o s e C L山东大学博士学位论文4 B 洗脱层析分离并确定样品组分的分子量范围。 热处理S D S - P A G E 电泳和H P L C检测复合体性质。电镜观察结果显示， 在生长的细胞表面有庆状突起， 细胞之间形成胞间连丝。细胞上的虎状突起物和胞间连丝随着细胞的生长繁殖而不断产生， 但随细胞在纤维上的滑动， 庆状物会脱落。 在菌落中， 大量增殖的细胞伴随纤维素的降解在原位堆积。 细胞扩展接触到的滤纸几乎完全降解， 而比邻的细胞未接触到的滤纸纤维保持完整。生长停止后的细胞表面光滑，没有疵状突起和胞间连丝。不同的菌株， 降解纤维素的活力不同， 与不同菌培养时观察到的浦纸的降解能力一致. 溶纤维素粘细菌的纤维素酶结合在细胞表面上， 在生长阶段不能分泌到 培养基中。 内 切纤维素酶和木聚 糖酶出 现较早， 之后是p 一 葡萄糖昔酶出 现， 外切纤维素酶活力很低。两步法可以有效地从细胞和纤维素底物的混合物中
