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1、山东大学博士学位论文葡萄子原花青素对糖尿病大鼠肾保护机制的分子生物学研究姓名：李宪花申请学位级别：博士专业：内科学（心血管病）指导教师：高海青20080310符号D MD NS DG S P ES T zA G E sR A G ET G F - 1 3lC T G FB M P sB M P 一7l O符号说明说明D i a b e t e sm e W m s糖尿病D i a b e t i cn e p h r o p a t h y糖尿病肾病S l i td i a p h r a g m足细胞裂孔隔膜F o o tp r o c e s s足突E x t r a c e l l u
2、l a rm a t r i x细胞外基质G r a p es e e dp r o a n t h o c y a n i d i ne x 廿a c t s葡萄子原花青素S t r e p t o z o t o c i n链脲佐菌素A d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t s非酶糖基化终产物R e c e p t o rf o ra d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t非酶糖基化终产物受体T r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t
3、 o r1 31转化生长因子B1C o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r结缔组织生长因子B o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s骨形态蛋白B o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n - 7骨形态蛋白7山东大学博士学位论文N F - kBG B Mm R N AR T - P C RN e p h r i nP o d o c i nC D 2 A Pv E G FI G FM C P I - lA n g I IN u c l e
4、 a rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r - kB核转录因子kBG l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n c e肾小球基底膜M e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d信使核糖核酸P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应R e v e r s et r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n逆转录一聚合
5、酶链式反应足细胞裂孔膜特异蛋白足细胞膜蛋白C D 2 A s s o c i a t e dP r o t e i nC D 2 相关蛋白V a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r血管内皮生长因子I n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r胰岛素样生长因子M o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n - I单核细胞趋化蛋白1P l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t h
6、f a c t o r 血小板衍化生长因子R e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s反应氧产物R e n i n - a n g i o t e m i n - a l d o s t e r o n es y s t e m肾素血管紧张素醛固酮系统A n g i o t e n s i nI I血管紧张素I I原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法
7、律责任由本人承担。论文作者签名：乏鱼塾E t期：! 壑：兰! 三关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：兰建垫导师签名：E t 期：兰壁：主：! 兰山东大学博士学位论文葡萄子原花青素对糖尿病大鼠肾保护机制的分子生物学研究研究生：导师：李宪花高海青专业：内科学( 心血管病)中文摘要研究背景和目的：随着生活
8、水平的提高，糖尿病发病率迅速增高，目前世界糖尿病患者大约l 亿7 千万人，其并发症在全世界范围内急剧增加。在糖尿病各种慢性并发症中，糖尿病肾病( D i a b e t i cn e p h r o p a t h y ，D N ) 是最主要的血管并发症，不仅发病率高，且最终发展为终末期。肾衰而致死，死亡率亦高。D N 已成为发达国家终末期肾衰的首位病因，在我国为终末期肾衰第二大病因。据美国肾脏病资料系统( U S R D S ) 的统计显示，超过3 0 的终末期肾功能衰竭为D N 所致。D N严重威胁人类的生命和健康，已成为世界关注的重要问题。D N 基本病理特征包括系膜基质合成增多，肾小球
9、基底膜增厚，从而引起肾小球硬化及肾小管间质纤维化。生长因子和细胞因子的过度表达如转化生长因子1 3l ( T r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r1 3l , T G F - B1 ) ，结缔组织生长因子( C o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r ，C T G F ) ，生长激素，胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子在D N发生和进展中起重要作用。目前认为，T G F - 1 3l 是己知的在D N 中致硬化作用最强的细胞因子。肾脏多种实质细胞，尤其是系膜细胞合成分泌T G F p
10、l ，并拥有其特异性受体。T G F - Bl 有自我诱生作用，即在损伤部位释放的T G F - B1 可诱导细胞产生更多的T G F - Bl ，从而在局部放大了其生物学作用。T G F Bl 可上调葡萄糖转运蛋白( g l u c o s et r a n s p o r t e r , G L U T ) 1 ，引起细胞内糖摄入增加和右旋( D )一葡萄糖增加；增加细胞外基质蛋白合成，如胶原I 、V 、纤连蛋白、层连蛋白等，增强细胞表面细胞外基质( E x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) 受体整合素的表达，使细胞与基质黏附增强，促使E
11、C M 在肾小球的沉积，促进系膜扩张，基底膜增厚；足细胞凋亡、分离，诱发基底膜剥脱；刺激足细胞分泌血管内皮生长因子，并抑制E C M 降解酶的合成与活性，使E C M 降解减少，从而促使肾小球硬化。阻断T G F 1 3l 活性能抑制E C M 的增加和减轻肾脏纤维化。但由于T G F - Bl同时具有抗免疫、抗增生效应，通过基因敲除的方法长期完全阻断T G F - p 的作用，动物不能生存。因而人们不得不继续探寻其更加特异的作用途径。C T G F 在D N山东大学博士学位论文发病过程中作为T G F Bl 的下游调节因子，介导T G F - 1 3l 的上述作用。体外实验显示，C T G
12、F 能诱导E C M 的合成增加，并且在高糖、机械张力、非酶糖基化终产物( A d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t s ，A G E s ) 和T G F - Bl 下，C T G F 在肾脏细胞表达明显增加。C T G F 可以和胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、T G F Bl 和骨形态蛋( B o n em o r p h o g e n e f i cp r o t e i n s ，B M P s ) 相互作用，并影响上述因子的信号传导。已有专家提出C T G F 可作为D N 治疗的新靶点。A G E s 及其受体在D
13、 N 的发病及进展中有很重要的作用。A G E s 在半衰期长的蛋白质( 胶原蛋白、晶体蛋白、弹性蛋白等) 及细胞壁上蓄积，使血管壁增厚，弹性降低。当肾小球基底膜增厚时，即使有效纠正高血糖，已被糖化的蛋白质也不能恢复正常。此外，糖化的蛋白质与基膜中重要的阴离子蛋白聚糖成分硫酸乙酰肝素的亲和力降低，清除增加，一方面损伤摹膜的电荷屏障，同时丧失抑制基膜及系膜增生的作用，从而导致基膜和系膜增生。A G E s 通过两种方式发挥作用：受体依赖性信息交联通路和非受体依赖性通路对肾脏造成损害。A G E s 与非酶糖基化终产物受体( R e c e p t o rf o ra d v a n c e dg
14、 l y c a t i o ne n dp r o d u c t ，R A G E ) 结合，可激活第二信号系统，产生大量细胞因子包括T G F - a 、血小板源细胞因子、白介素一l 等，对肾小球及肾小管间质造成不可逆转的损伤。除了这些促纤维化的生长因子外，已有报道抗纤维化的生长因子骨形态蛋白质7 ( B o n em o r p h o g e n e f i cp r o t e i n s 7 ，B M P - 7 ) 在D N 中是下调的，并能拮抗实验性D N 的纤维化。B M P 7 作为纤维化的负性调节因子，通过维持上皮细胞表型、抑制肾脏上皮细胞的凋亡、促进E C M 的降解
15、、减少多种促炎症因子的表达、影响T G F 1 3 S m a d s 传导途径以及与T G F - 1 31 的互逆作用，对肾间质纤维化起到预防及逆转作用。近年来，大量研究提示足细胞损伤与缺失可能是导致肾小球硬化的一个中心环节。蛋白尿和E C M 积聚较多的D N 病人足细胞少于有着相同病程但没有蛋白尿和肾小球硬化的糖尿病病人。提示足细胞损伤在D N 的发病及进展过程中亦有很重要的作用。N e p h r i n ，p o d o c i n ，C D 2 A P 是足细胞裂孔隔膜上的跨膜蛋白，肾小球滤过屏障的分子成分，具有多种生物活性功能。它们的正常表达及分布对维持滤过膜完整的形态结构和屏
16、障功能有着重要意义。若发生异常将导致大量蛋白尿的产生。已有研究证实并发肾病综合征的糖尿病患者肾小球n e p h r i n 染色明显减少，糖尿病大鼠模型中亦证实有n e p h r i n 表达的下降。2山东大学博士学位论文目前防治D N 的措施包括有效控制血糖，控制系统性高血压，抑制肾素- 血管紧张素系统( R A S ) ，控制血脂障碍等。虽然这些措施可以减缓蛋白尿的增加和肾功能减退，减少死亡率，D N 仍然是一个巨大的临床课题，迫切需要更有效的治疗措施。葡萄子原花青素( G r a p es e e dp r o a n t h o c y a n i d i ne x t r a c t s ，G S P E ) 是一类在植物界广泛存在的具有抗氧化作用的多酚化合物，是一种新型高效抗氧化剂，是目前为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有非常强的体内活性。其抗自由基氧化能力是维生素E 的5 0 倍、维生素C 的2 0 倍。近年来国外研究发现G S P E 有心血管保护作用，它的自由基清除能力可抗心肌缺血再灌注损伤，通过抑制低密度脂
