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1、应用与环境生物学报 2006, 12(3): 399 403 Chin J A pplEnviron B iol=ISSN 1006- 687X 2006- 06- 25甲胺磷农药降解菌 HS-A32的分离鉴定及降解特性*郑永良1刘德立2*高 强1王 玮1师晓爽1( 华中师范大学1生命科学学院,2农药与化学生物学教育部重点实验室 武汉 430079 )摘 要 从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株降解菌 HS- A32, 能以甲胺磷作为唯一的碳源和氮源生长. HS-A32菌降解甲胺磷的最适温度为 30 , 最适 pH值为 7 . 0, 甲胺磷的最适降解浓度为 1 000mg /L, 降解率达
2、 82%. 聚酰 胺薄层色谱(TLC)可检测到降解产物中有 NH+ 4生成. HS- A32菌能以多种碳、氮源生长, 外加可利用的碳源和氮源能促进甲胺磷的降解. 通过 16S rDNA扩增、测序, 运用 BLAST检索分析, 构建系统进化树. 结合生理生化鉴定, 初步确定 HS- A32为不动杆菌属(Acinetobacter). HS- A32菌还能降解甲基对硫磷等多种有机磷农药. 图 6表 1参 14关键词 甲胺磷; 生物降解;16S r DNA; 降解特性 CLC X172Isolation and Characterization of a Bacterium HS- A32 Capa
3、ble ofDegradingM etham idophos*ZHENG Yongliang1, LI U Deli2*, GAO Qiang1, WANG Wei1 SH IXiaoshuang1(1College of Life Sciences,2Key Laboratory of Pesticide ChemicalB iology ofM inistry of Education, Huazhong Nor malUniversity, Wuhan 430079, China)Abstract A bacterium HS- A32 capable ofdegrading metha
4、midophoswas isolated fro m long - ter m organophosphate pesticidespolluted soi.l This strain can usemetha m idophos as the sole carbon and nitrogen source . The optimal gro w th conditions inclu- ding temperature,pH and concentration ofMAP were deter mined,. i e . , 30 ,pH 7. 0 and 1 000mg /L MAP. T
5、he rate ofdegradingMAP was 82% within 2 days, and NH+ 4could be detected by thin layer chromatography (TLC) with DNS- C. l HS- A32 could also degrade other organophosphate pesticides,such asmethylparathion . Several carbon and nitrogen sources couldbe used by HS- A32 . The efficiency ofMAP degradati
6、on was increased by adding available carbon and nitrogen sources . The characteristics ofHS- A32were investigated by 16S r DNA a mplification, sequencing and blastanalysis . The phylogenetic tree ofHS- A32was constructed. These results of physiologicaland bioche mical tests indicate thatHS- A32 belo
7、ngs to the genusAcine- tobacter . Fig 6, Tab 1, Ref14Keywords metha m idopho;biodegradation;16S rDNA;degradation characteristics CLC X172名称为 O, S- 二甲基胺基硫代磷酸酯, 是一种具有广谱、内吸、胃毒、触杀等特性的高效有机磷农药, 能有效防治多种农作物 (如棉花、大豆、马铃薯及水稻等 ) 虫害, 是目前全世界使用量最大的有机磷农药之一 1. 该农药对人畜毒性强(雄性大白鼠急性经口毒性 LD50为 80 mg /kg), 有一定的残留期 2. 由于长期大
8、量使用, 所引起的水质和土壤污染已严重地危害到人体健 康, 破坏了生态平衡, 治理此类农药污染对人类社会可持续发 展具有重要意义 3,4. 微生物降解有机污染物具有成本低、二次污染少、反应条件温和等优点, 目前已有不少学者进行了相 关研究 5 8. 本文报道从长期受有机磷农药污染严重的土壤中分离到一株甲胺磷高效降解菌, 对其生理生化特性进行了鉴 定, 并对该菌降解有机磷农药包括甲胺磷、甲基对硫磷等的特收稿日期:2005- 08- 08 接受日期:2005- 12- 14 *国家自然科学基金(No.30170011)和国家重大基础研究项目 (N o . 2004CCA00100)资助 Suppo
9、rted by the NationalNaturalScience Foun- dation ofChina and the State Key Pro ject forBasic Research ofChina *通讯作者 Corresponding author(E- mail :deliliu2002yahoo . com. cn)性作了初步研究.1 材料与方法 1 . 1 农药标准品及生化试剂 50%高效甲胺磷乳油及 99. 0%标准品, 均由湖北沙隆达 农药股份有限公司提供. 生化试剂购自湖北天源生物药品公司. 1 . 2 培养基 无机盐培养基(A):KH2PO40. 5 g,
10、K2HPO41. 5 g, NaCl 0. 5 g, M gSO4 7H2O 0. 5 g; 痕量元素溶液 1 . 5 mL, 加水至 1L .1 L痕量元素溶液含:CaSO4 5H2O 4. 0 g, FeSO4 7H2O 0. 7 g, FeCl3 6H2O 7 . 0 g, CoCl3 6H2O 0 . 2 g, Na MO4 2H2 O 3. 4 g, CaCl2 2H2O 2. 0 g, 调节 pH =7. 0. LB培养基(B):酵母膏 5 . 0 g, 蛋白胨 10. 0g, NaCl 5 . 0 g,加水至 1 L, pH 7. 0 . 固体培养基加琼脂 15. 0 g /L
11、. 121高压 灭菌, 备用. 1 . 3 菌株分离 从湖北黄冈市市郊棉田长期受有机磷农药污染土壤采样. 取土样 10 g放入 250 mL三角瓶中, 加 A 培养基 100 mL及50%甲胺磷乳油(MAP终浓度达 300 mg /L), 摇床培养 4 d(30 , 120 r / m in) . 以后按 5%的接种量再进行 3次富集培养 , 每次 4 d, 并逐步提高 MAP浓度分别达到 500、1 000、1 500mg /L . 取第 4次富集液在 A 固体培养基平皿上涂板(不加农药的 A培养基作对照 CK) . 1 . 4 降解菌生理生化鉴定 生理生化鉴定参考文献 9 进行.1 . 5
12、 降解菌的 16S rDNA鉴定 细菌总 DNA提取按文献 10所述方法进行, 并 PCR扩增 16S rDNA 11. 引物由上海基康生物公司合成. 正向引物 P- f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 反向引物 P- r :GGTTACCT TGT- TACGACTT . PCR反应体积 100 L, 其中 10 PCR buffer 10L, 25 mol /L dNTP 8 L, 20 mol/L正向引物 P- f和反向引 物 P- r各 4 L, 模板 DNA 1 L,Taq酶 5 U, 加超纯水补足至100L . PCR反应条件为:94 预变性 5 min; 然后 94
13、变性 30 s, 55 退火 30 s, 72延伸 1m in; 30个循环后, 72延伸10 min . 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR反应产物. DNA 序列测定由 上海基康公司完成. 测定的序列用 BLAST软件在线检索分析.1 . 6 最适生长条件测定 在含 500mg /LMAP为唯一碳、氮源的无机盐培养基中按 5%接种量接入 HS- A32菌悬液, 分别在不同温度(15、20、 25、30、35、40、45 )、不同 pH值(4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0、 10 . 0)、不同 MAP浓度(100、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3
14、 000 mg /L)的 无机盐液体培养中进行单因素多水平实验. 摇床培养 3 d, 测定各自 OD600 nm及降解率. 每一单因素实验重复 3次. 1 . 7 聚酰胺薄层色谱分析 (TLC) 取降解菌液 1 mL, 离心取上清, 并按文献 12 所述方法进行薄层色谱分析. 1 . 8 碳 、 氮源利用及对 MAP降解的影响 分别在无氮培养基中加入 1%氮源, 或在无碳培养基中加入 1%碳源. 按 2%的接种量接种菌悬液,30 摇床培养 18 h 后测 OD600 nm值. 另在 MAP无机盐液体培养基中, 分别进行实验:(a) 添加 100 L 0. 1%的葡萄糖溶液;(b) 添加 100
15、 L 0. 1%的 NH4Cl溶液;(c)同时添加上述两种溶液;(d) 不添加上述两种溶液. 测定各自的菌体生长量及 MAP降解率. 1 . 9 HS- A32广谱降解性实验 在 100mL A培养基中各添加浓度为 200 mg /L的有机磷 农药甲基对硫磷、辛硫磷、三唑磷、敌敌畏, 30摇床培养 6 d, HPLC测定各自降解率. 1 . 10 有机磷农药测定 采用 ASM K ro masilC18反相柱(2 . 515 c m) 高效液相色谱 (HPLC, Beckman Co . ) 测定各农药含量, 以甲醇- 水为流动相,流速 1. 0 mL / m in, 进样量 20 L . 各
16、农药 HPLC检测的其它条 件如表 1.表 1 不同有机磷农药 HPLC检测条件 Table 1 HPLC conditions of different organophosphate pesticides农药 Pesticides甲胺磷 M etham idopho甲基对硫磷 M ethy l parathion三唑磷 Triazophos辛硫磷 Phoxi me敌敌畏 D ichlorvosV(M ethanol) : V(H2O)30 :7030 :7015 :8530 :7030 :70 /nm2152542152542542 结 果2 . 1 降解菌株的筛选和鉴定 采用多次富集筛选, 共筛得能以 MAP作为唯一碳源和氮 源的菌株 48株( 细菌 44株、真菌 4株), 所选菌株在不加 MAP的 A 培养基上不生长, 而在加 MAP的 A 培养基上生长. 其中 HS- A32菌株生长迅速、菌落较大, 表明其对 MAP 的降解能力较
