植物基因工程的新突破_植物rna_省略_作为基因工程载体系统的现状与展望_缪刚

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1、植物基因工程的新突破 植物R NA病毒作为基因工程载体系统的现状与展望缪刚王鸣岐(复旦大学)植物基因工程领域研究工作的快速发展,日益引起人们的关注.在将外源 顺序导入植物寄主中去的植物基 因工程的载体系统中,冠瘦瘤农杆菌的Ti质粒和植物花椰菜花叶病毒是两类研究得最多的载体系统.冠痪瘤农杆菌以许多双子叶植物为寄主,花椰菜花叶病毒的主要寄主则为十字花科和某些茄科植物.他们的寄主范围在一定程度上限制了这两类载体在以单子叶植物为主的经济作物上的运用.因而感染这 些经济作物的许多植物R NA病毒就 自然而然地引起了植物分子生物学家的兴趣.近 几年的研究表明,植物R N A病毒是使高等植物获得外源基因的颇

2、具前途的天然载体系统.自198 4年阿尔奎斯特(PaulA hlquist)1小组首次从克隆的体外转录系统中获得仍然具有感染力的植物 病毒R NA基因组 后,次年又获得了重大突破2,他们首次利用植物R NA病毒雀麦花叶病毒(BMV)的载体系统,使细菌氯霉素乙酞转移酶基因(CAT)成功地在单子叶植物大麦原生质体中得到了表达.雀麦花 叶病毒主要含有3条基因组R NA,分别包装在3个病毒颗粒中,他们对病毒的感染功能都是必 需的.在含RNA3的颗粒中还有一条来自R NA3的亚基 因组R NA4,RNA4是功能mRNA,负责编码病毒的外壳蛋 白,而不是病毒的基因组RNA复制及感染所必需的.R NAI和R

3、 NAZ皆为单顺反子,与病毒RNA基因组的复制有关,RNA3则为双顺反子,一个是外壳蛋白基因,另一个功能不明.既然外壳蛋白基因不是病毒RNA复制与感染所必需确多亲志1 0 卷5期的,那末外源顺序就有可能取而代 之插入到病毒的RNA3中.根据这一 设想 构建了3种质粒:(i)携带RNA1eDNA的PBIPMls(PBI),(11)携 带RN AZeDNA的PBZpM25(PBZ),(111)携带RNA3eD NA的PB3pMI(P B3 ).这3类质粒经克隆后的体外转录产物的混合物仍然具有感染性,为此改建PB3质粒,用限制性内切酶Sa ll和xb al切 去外壳蛋白基因,然后 连接入细菌的氯霉素

4、乙酞转移酶基因从而构建成新质粒pB3D(如图l).质粒P Bi、P BZ、PB3D在E.eoli中 克 隆,经体外转录,这3类质 粒的转录产物混 合物去感 染培养的大麦原生质体,虽然分子杂交测得R NA3的量较用P B3去感染的所测值约少6 1 5倍,但CAT的活性却非常地高,比海瑞拉一伊斯特 瑞 拉(He r r e r a一Estr ella)“用光诱导核酮糖l,6二磷酸轻化酶小亚基启动子所表达的CAT活性高7倍,又较用T i质粒中服脂碱合成酶启动子所表达的CA T活性高2 3倍.这些结果表明某一种植物RNA病毒不仅可以被工程化,而且还是一个方便且又有效的基因表达载体,我们 认为 这一工程

5、化的 方法可能并不仅限于雀麦花 叶病毒,对 于与 之相 似而寄主范围不同的其他植物R NA病毒或许也有着潜在的广 泛运用.目前国内外以植物R NA病毒为载体系统的研究工作正 在以下4个领 域 中进行.(一)植物RNA病毒的 分子 生物学研究植物RNA病毒按其基因组的分布可分为仑 备Sall义balR NA 3 c咒一卫NA3cm了G卿G U AU UAAU弃扭绝Uc GAM.5CG AG AUUUUC AG GGc UA A A回G A G少TRFSGAK它AoKM.E。二图1雀麦花叶病毒的基因组RNA3的改建 限制性内切酶S a ll和xbal切去外壳蛋 白基因,然后插入外源顺序细菌氯霉素乙

6、酞转移酶基因两种:(i )病毒所含的所有遗传信息皆集 中在一条RNA链上的单颗粒病毒,如烟草花叶病毒,( ii )遗传信息分布在不同的R NA链上的所谓分裂基因组的多颗粒病毒,如雀麦花叶病毒.前者因容纳了全部的遗传信息,故RNA分子比较大,这使体外基因操作比较困难,相比 之下带分裂基因组的病毒RNA分子就较小,易于进行体外操作.许多感染真核生物的病毒正链RNA常含有儿个顺反子,但往往只有靠近6末端的顺反子 才是可转译的蕊.真核生物中由于转译对6末端mR N A的特定 顺序和6帽子结构的需要使转译限于5末端,但顺序分析表明转译区的前段顺序并无明显的共同特征t61,而且转译时帽子结构本身也是可以缺

7、失的“,移去帽子并不抑制转译起始,仅 仅影响其合成的速率 7 .而某些真核生 物病 毒I nR N A本身虽 然不带帽子结构,也仍 然 能正常转译,甚至无帽结构的原核mRNA中内部的顺反子 也可被真核生物核糖体所识别而起始转译“.雀麦花 叶病毒是一个较小的二 十面体的谷类植物病毒,有关BMV编码区域的定位及转译已有了很多知识的积 累.雀麦花叶病毒基因组含有3个不 同的R NA分子,按其分子大小分为RNAI、RNAZ、R NA3,它们分别包装在3个颗粒中 0 1,这些RNA是病毒感染所必需的.在含RNA3 (2.Zk b)的颗粒中还有一条亚基因 组拷贝RNA4 (0.9k b),这是以R N A

8、3中的外壳蛋 白基因为模板合成的亚基 因组,虽 然它不为病毒感染所必 需,但却有着mRNA功能,负责编码病毒的外壳蛋白.R NA3的体外转译产物只有一个,由靠近6末端的顺反 子转译,分子量 为3 5kd。的多肤,称3 a,它明 显不同于外壳蛋白(2 0kd a),所以RNA3至 少含有两个顺反子,其中的外壳蛋白基 因由于某种原因在RNA3中不活动,而以其亚基 因 组RNA4的形式执行编码外壳蛋白的功能.在转译肤链的延伸过程受到抑制的麦胚体外翻译系统中,发现RNA3上结合有两个核糖 体,而R NA4上仅结合一个.由此推测真核生物核糖体结合到RNA3的过程 有两个步骤l “.第一步是8 0“核糖体

9、首先结合到mRNA的进入位点(e ntr ysite),第二步5 05沿mRNA移动直到起始位点(initiationsite)的AUG密 码子处.如果mR NA起始区前6末端的不 翻译顺序足够长,从 而使进入位点与起始位点在空间上隔离,如RN A3,TMv 11,则在第一个1 0卷5期确多亲 志8 0。朝AUG移动过程中可使第二个80 5结合到空位的进入位点,但如果6末端不转译区很短,如R NA4,则使进入位 点与起始位点有部分 重 叠甚 至重合,这样在翻译延伸受到阻遏的系统中,也就只能使一个80 5结合了.这种进入位点与起始位点的融合可能有使转译呈高效性的作用,而 空间上的隔离也许有着转译

10、调控等更复杂的机制.在雀麦花叶病毒的4条R NA中,它们的3,末端非编码区顺序有着惊人 的相似l幻,而 且都是可酪氨酞化.这表明存在着一种能与某种蛋 白起特定作用的精确的空间构型l“1,同时3 ,末端的这种完整性是感染所必需的1鑫.在雀麦花叶病毒同一群 中的蚕豆斑 驳病毒(BBMV)、可 豆褪绿斑驳病毒( CCMV)以及关系较远一些的黄瓜花叶病毒(CMV),它们也都与雀麦花叶病毒相似,为分裂基因组病毒,含4条R NA链,顺序分析表明这4类病毒中,同一类病毒的RNAI、R NAZ、R NA3、R NA4这4条R NA之间以及不同类病毒的这相应的4种R N A之间的3末端约20 0个核昔酸,都有着

11、 很 大 的同 源性.更有趣的是这些3末端区域皆因链内氢键 的互 相配对而形成排列规 则的78个基环结构,颇似tRNA的二级结构.这 种 一级结构、二级 结构的高度保守性,使人推测也许是 由于 这些病毒的复制,感染过程中存在着某种特异的共同机制.在雀麦花叶病毒RNA3的双顺反子之 间,即3 a与外壳蛋白基因之间,有一段不编码 的顺序,该顺序含有多聚腺嚓吟,这一结构在cD N A合成中被发现是个异乎寻常的高效引物位点 l们.R NA3的全顺序已经测定1 61,如图2.研究发现RNA3的6末端的不 翻译前导区具有许多植物R NA病毒mRNA的典型特征,即鸟嗓吟百分含量较小(1 5 %).例如芜背黄

12、花叶病毒mRN A的5末端相应区域(G%)仅为1 0% 7,甚至有许多植物病毒mR NAS末端不编码区几乎不含鸟喋吟l“.RNA3的6末端不翻译区的另一特征是富含尿嘀吮,有几个多尿嗜咤区的循环,这又很类似于 首楷花叶病毒4条RNA相 应 区域的多U特征1 。.3 a与外壳蛋白基因间的P ol yA结构是不均一 的,从1 6个核昔酸到2 2个核昔酸,可见该P ol yA结构的精确长度为其功能不 必需.195 3年BMV的R NAI和R NAZ的全顺序也被测定完毕2 “.RNAI有3 234个核昔酸,RNAZ有28 66个核昔酸,它们分别编码10 90 00道尔顿和9 40 00道尔顿的一种蛋白质

13、.以病毒正链RNA为基础的BMV的感 染、RNA转译、复制、包装的各个过程之间被认 为存在着某种非常有效的调节作用.解释 这种调 节作用的机理的 一种假说认为,由于BMV的各条RNA链3末端区域具有约20 0个核昔酸的同源性及其二级结构的相似性、3末端的可 酪氨酸化性,使得各R NA的3末端区具 有 转译延伸因 子I(E F一I )结合位点、BMVR NA多聚酶 识别与起始位点,外壳蛋白包装的起始位点.不 同的蛋白质的结合位点集中在这样的一小段R N A上,表明它们各自的功能之间并非是完全独立的,它们也许有着互相协作或互相 拮抗的关系.E F一I的结合与RNA复制酶 的结合的拮抗作用,使病毒使

14、用E F一I的水平与寄 主细胞中的实际转译能力相适 应.这两种 蛋白质对RNA特定位点的拮抗结合作用使病毒的转译与复制之 间存有某种平衡.如果病毒R NA与RNA复制酶增多,将使得复制过程利用更多的RNA,但 由于EF一I结合RNA的性质形成某种平衡,使得一定数量的RNA不能被结合复制酶,这使转译得以进行并且与增 多的RNA量相适应.R NA3末端的外壳蛋白包装起始位点使外壳蛋白结合,而阻止进一步的RNA复制起始.这种在3末端的病毒颗粒的极性包装将使以前已经起始的复制酶复合物从病毒RNA上掉下而不 干扰其包装.外壳蛋自的累 积促使感染进入后期,这 时继 翻译和复制之后的包装使成熟病毒产生.研究

15、又发 现指导模板选择的信号也主要存在 于3末端,尤其集中于最后的3 9个核昔酸中21,并且RN A的复确去余志20卷5期325PNA4polyA 朋A 3厂-牛 l! !l Il ,. 核昔酸数。9 1l!l】,!l:高. :1晶。 1 24 ! 1,5 1图2雀麦花叶病毒基因组RNA3的一级结构制是从头起始的(den ovoinitiatio n),而 不是以自身模板为引物的起始,即BMVR NA多一 聚酶并不是在某个R NA或DNA引物存在下延。伸R NA的复制合成.最近在病毒的比较研究中又发现在几类不同的病毒中,它们所编码的非结构蛋白的顺序存在着类同性22.首楷花叶病毒R NAI与雀麦花

16、叶病毒RNAI所编码的蛋白质以及烟草花叶病毒的P126三者之间,首楷花叶病毒R NAZ与雀麦花叶病毒RNAZ所编码蛋白质以及烟草花叶病毒P18 3之间,存在着较大的同源性,这一结果表明尽管病毒基因表达的战略性不同,但这些蛋白质在功能上也许还在起源上存在着某 种联系.更有趣的是以上两类同源性的前者还与动物病毒Si ndb i病毒的非结构蛋 白n SPI、nspZ,后者则与该动物病毒的n SP4,存在着顺序类同性2 3.这无异 令人 想到即使动植物病毒之间,它们 的复制机理及起源 也有着相似性.除了植物RNA病毒的基因组外,还 有 一类卫星RNA油于它们较小且为病毒的感染复制所必需,有作为基因载体的潜在可能性,它们因不来源 于基因组RNA而明显区别于亚基因组RNA 2魂,虽然他们的复制依赖于基因组R NA,但它们是以自身为模板而复制 合 成的叫,它价的复制中间态已被检洱到,从卫星RNA虽为病毒感染所必需,却可明显影响 病毒的