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1、第 5 卷 第 12 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 5 No. 12 2014 年 12 月 Journal of Food Safety and Quality Dec. , 2014 基金项目: 华中农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目(20130504035) Fund: Supported by the National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship of Huazhong Agricultural University (20130504035) 通讯
2、作者: 刘晓宇, 博士, 教授, 博士生导师, 主要研究方向为食品安全与农业资源综合利用。E-mail: *Corresponding author: LIU Xiao-Yu, Professor, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China. E-mail: 化学发光生物传感器法测定食品中有机磷与氨基 甲酸酯类农药残留 王晓朋1, 曾 梅1, 万德慧1, 唐 晗1, 赵彬媛2, 周雅倩2, 刘晓宇1, 2* (1. 华中农业大学食品科技学院, 武
3、汉 430070; 2. 环境食品学教育部重点实验室, 武汉 430070) 摘摘 要要: 目的目的 构建一种用于检测食品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留的高灵敏度生物传感器, 建立一种用于测定食品中两类农药残留的新方法。方法方法 以固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)为识别元件与底物碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)特异性反应, 采用微流控芯片与化学发光仪作为检测元件, 以鲁米诺与铁氰化钾作为化学发光体系, 通过流动注射分析法来检测农药残留。结果结果 当有机磷类农药辛硫磷、敌敌畏、乐果浓度范围分别在0.110、 0.0810、 0.815 g/mL 时, 相关系数分别为 0.9923、 0.9903、 0
4、.9904, 检出限分别为 0.047、 0.054、 0.388 g/mL; 当氨基甲酸酯类农药克百威、西维因、灭多威浓度分别在 0.0815、0.110、0.110 g/mL 时, 相关系数分别为 0.9926、0.9972、0.9944, 检出限分别为 0.049、0.051、0.080 g/mL。传感器性能评价实验结果显示, 在最佳条件下对辛硫磷、敌敌畏、乐果、克百威、西维因、灭多威分别测定 6 次, 结果 RSD 值均小于 7%, 精密度较好; 以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物, 连续通入鲁米诺与铁氰化钾化学发光体系 6 次, 所得 RSD 值小于 8%, 稳定性较好; 将实验制
5、备的固定化 AchE 储存于 pH 值为 8.0 的磷酸盐缓冲溶液中, 每隔 10 d 测一次化学发光峰值, 结果显示两个月内相对活力下降为 23%, 保存时间较长; 将传感器用于测定包菜、苹果样品中的农残, 添加回收率在 90%99%之间, 显示精密度较好, 可用于测定食品中的农药残留量。 结论结论 此生物传感器性能良好, 适用于测定食品中的有机磷与氨基甲酸酯类农残。 关键词关键词: 有机磷; 氨基甲酸酯; 乙酰胆碱酯酶; 微流控芯片; 化学发光; 生物传感器 Determination of organophosphorus and carbamates pesticide residue
6、s in foods by chemiluminescence biosensor WANG Xiao-Peng1, ZENG Mei1, WAN De-Hui1, TANG Han1, ZHAO Bin-Yuan2, ZHOU Ya-Qian2, LIU Xiao-Yu1,2* (1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Key laboratory of Environment Correlative Dietology, Mini
7、stry of Education, Wuhan 430070, China) ABSTRACT: Objective To create a high-sensitivity biosensor for detecting organophosphorus and carbamates pesticides in foods and establish a new method to determine these two kinds of pesticides. Methods Immobilized acetylcholinesterase (AchE) was used as reco
8、gnition element of the sensor, reacting specifically with the substrate of acetylthiocholine iodide(ATCI), the micro-fluidic chip with CL analyzer was used as 4164 食品安全质量检测学报 第 5 卷 detecting element, and luminol-potassium ferricyanide system was used in chemiluminescence system. Results When the con
9、centration of proximal, dichlorvos, dimethoate ranging from 0.110, 0.0810, and 0.815 g/mL, respectively, the correlation coefficients were 0.9923, 0.9903, and 0.9904, and the detection limits were 0.047, 0.054, and 0.388 g/mL, respectively. When the concentrations of carbofuran, carbonyl, and methom
10、yl were ranging from 0.0815, 0.110, and 0.110 g/mL, respectively, the correlation coefficients were 0.9926, 0.9972, and 0.9944, and the detection limits were 0.049, 0.051, and 0.080 g/mL, respectively. The evaluation of biosensor performance indicates good precision, when determining all 6 kinds of
11、pesticides under optimal conditions, RSD was below 7%; when the substrate of ATCI was injected into chemiluminescence system 6 times discontinuously, RSD was below 8%, which indicated good stability; immobilized AChE was stored in phosphate buffer(pH=8.0), detecting activity every 10 d, lasting for
12、two months, the relative enzymatic activity decreased only 23%, indicating a good storage stability; the biosensor was used to detect samples of cabbage and apple, fortified recoveries were between 90%99%. Conclusion This biosensor has a good performance, therefore it can be used to determine pestic
13、ides in foods. KEY WORDS: organophosphorus; carbamates; acetylcholinesterase; micro-fluidic chip; chemiluminescene; biosensor 1 引 言 农药的应用对于我国农业的发展发挥了巨大的作用, 有机磷与氨基甲酸酯类农药是其中的重要组成部分。 但是农药滥用的同时也对环境及人体带来了无法避免的危害。有机磷及氨基甲酸酯类农药俗称“神经毒剂”, 能与人体兴奋传导物质乙酰胆碱的分解酶乙酰胆碱酯酶特异性结合, 使人痉挛, 严重则会导致死亡1。因此, 国家标准规定了农药使用的限量标准2, 而
14、为了执行这些标准, 就必须有与之对应的检测方法来测定农药残留, 以判断农药是否超标。 现行的农药残留测定方法有气相色谱质谱联用技术、 高效液相色谱法、 波谱法等3,4, 但这些方法如高效液相色谱法, 前处理较复杂, 专业性较强, 设备成本昂贵, 无法满足现场检测、快速检测的目的。此外还有免疫分析法、酶抑制率法、速测卡法5-7等快速检测方法, 也存在对有机磷农药敏感性差、性质不稳定的缺点。而应用生物传感器8能够弥补上述方法无法满足的现场、快速检测的需求。据文献报道9,10, 酶生物传感器对有机磷与氨基甲酸酯类农药的检测有较好的重现性与稳定性。 本研究将化学发光与固定化乙酰胆碱酯酶11,12生物传
15、感器结合, 旨在构建一种快速检测有机磷与氨基甲酸酯类农药的残留的新方法。 生物传感器由识别元件、 转换元件及检测元件构成, 由识别元件承担特异性识别及反应工作, 之后经换能元件将生化信号转化为可识别的电信号, 以达到检测的目的13,14。与传统方法相比, 生物传感器有灵敏度高、选择性好、分析速度快的特点15。 2 材料与方法 2.1 仪器与试剂 BPCL 微弱化学发光仪(中国科学院生物物理所); HL-2 恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司); 超声波清洗器 SB-3200DT(宁波新芝生物科技股份公司); 组织捣碎机(PHILIPS); 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); AB204-E 电
16、子分析天平(上海天平仪器厂); 722可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司); HH-4 恒温水浴(国贸电器有限公司); AB204-E 电子分析天平(上海天平仪器厂); DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(武汉科尔仪器设备有限公司)。 碘化硫代乙酰胆碱(ATCI, 纯度 99%, Sigma 公司); 电鳗乙酰胆碱酯酶(AChE, Sigma 公司); 壳聚糖(250g, 脱乙酰度 96%, 分子量 30 万, 浙江金壳生物化学有限公司); 铁氰化钾(500g, 纯度99.0%, 天津市塘沽区德华化学试剂); 鲁米诺(1g, 纯度 99%, 美国 Sigma 公司); 解磷定(2-PAM, 25 g,纯度 99%, 美国Sigma 公司); 敌敌畏标液(100 g/mL, 农业部环境保护科研监测所研制); 辛硫磷标液(100 g/mL, 农业
