《一氧化氮内皮素在大鼠胃粘膜损伤中作用及电针调整效应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一氧化氮内皮素在大鼠胃粘膜损伤中作用及电针调整效应（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 1998203220收稿 1998205225修回3国家自然科学基金资助(No139670308)1联系作者生理学报, 1999年4月, 51 (2) , 199205 199 Acta Physiologica Sinica人SOD1基因在大鼠血管平滑肌细胞的 表达及对抗氧自由基损伤的作用3郑新程 安 威1 白景香2 毛松华 伍贻经(北京医科大学病理生理教研室,北京100083;1首都医科大学细胞生物系,北京100054;2北京医科大学人民医院普外科,北京100035)摘 要 本实验构建含人铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)基因的逆转录病毒载体,将其导入离 体培养的鼠血管平滑肌细胞(VSMC
2、s) ,观察hSOD1基因表达及其抗氧自由基损害作用。 结果表 明: (1)载体构建策略和方法正确, hSOD1基因可在靶细胞中高效稳定表达; (2)转化hSOD1的VSMCs可对抗大剂量氧自由基对细胞的直接损伤作用; (3)小剂量氧自由基刺激VSMCs增殖, 而转化hSOD1的VSMCs增殖反应受到抑制。 本研究结果提示,外源性表达的SOD可能通过抗 自由基损伤和抑制内皮细胞增殖两方面作用阻止动脉粥样硬化的形成。关键词:超氧化物歧化酶;基因;血管平滑肌细胞;自由基 学科分类号: Q78大量的研究结果表明,氧自由基(oxygen2free radicals , OFRs)介导的脂质过氧化损伤是
3、 动脉粥样硬化(atherosclerosis , As)发病的主要诱因之一1。 氧自由基一方面攻击血管内皮 细胞,使其完整性受到损害。 破损处所沉积的血小板被激活后,释放出血小板源性生长因 子(platelet2derived growth factor , PDGF) ,后者促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells , VSMCs)高度增殖。 增殖的VSMCs与单核细胞和成纤维细胞一道向血管内膜迁移并 在此积聚,造成血管内径狭窄2。 另一方面,氧自由基亦可使内皮细胞的内分泌功能受到 损害,阻止其合成前列环素(PGI2) ,内源性舒张因子(EDRF)等,影
4、响血管的正常舒张功 能3。 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)是体内氧自由基的特异性清除剂。 据报 道, As的发生与SOD活性降低有关4。 据此,我们构建含人Cu2Zn SOD(hSOD1)基因的载 体,将其导入VSMCs ,得到稳定高效转化细胞,观察其基因表达的抗氧自由基损伤作用, 为As基因治疗的可行性研究提供理论依据。1 材料与方法111 含hSOD1基因载体的构建 将hSOD1cDNA(美国Bionike公司王凯华教授惠赠)正 向插入到逆转录病毒载体XM26的5LTR启动子下游,得到重组体XM26/ SOD(图1) ,以酶 切法判定插入方向正确与否
5、5。 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.图1 含人铜锌SOD基因逆转录病毒重组体的构建 Fig11 Illustration of the construction of a retroviral vector containing hSOD1genehSOD1gene inserted into Hindand Bglsites of the XM26 vector.112 载体的包装及滴度测定6 利用脂质体(lipofectin , Boehringer Mannheim公司生产)介
6、导的基因转移方法将XM26及XM26/ SOD DNA导入包装细胞系PA317。 经G418 (GIBCO公司生产) 400g/ ml筛选1012 d ,可见阳性克隆,选取68个克隆继续培养。 至汇合时,吸取培养基,以4000 r/ min离心5 min ,取上清,以NIH3T3为靶细胞,测定上清中病毒滴度。 将滴度大于5105cfu/ ml克隆保存于- 70 备用。113 VSMCs细胞培养、 鉴定及转染 取第23代正常血压WKY大鼠胸主动脉中层VSMCs细胞(北京医科大学生物物理系惠赠) ,以含10 %小牛血清的DMEM培养基培养。 应用小鼠抗SMC2 2actin的单克隆抗体(Sigma
7、公司生产)进行VSMCs免疫荧光及免疫组化染色,旨在鉴定细胞培养中是否混有成纤维细胞,以NIH3T3细胞作阴性对照。 接种215105个生长状态良好的VSMCs于50 ml培养瓶中培养,待细胞长至汇合率达50 %70 %时弃去培养基,加入病毒上清液5 ml及8g/ ml polybrene ,培养6 h ,更换成正常培养基继续培养。24 h后加入G418 400g/ ml筛选, 1020 d出现阳性克隆。 继续将克隆扩大培养,得到XM26及XM26/ SOD的两种转化VSMCs细胞。114 Southern和Northern杂交7 以酚2氯仿法提取上述两种细胞基因组DNA ,取15gDNA ,
8、经限制性内切酶消化, 018 %琼脂糖凝胶电泳,将凝胶中的DNA转印至尼龙膜,以随机引物法将 232P2dCTP标记于hSOD1cDNA ,制备探针(标记试剂为Promega公司生产)。 以异硫氰酸胍(GTC)裂解上述两种细胞并以酚2氯仿一步抽提法提取总RNA(GIBCO公司生产)。 取20g RNA经110 %甲醛变性,琼脂糖凝胶电泳,再将凝胶中的RNA转印至尼龙膜。hSOD1基因探针分别与两膜杂交并进行放射自显影。002生 理 学 报 51卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.115
9、 细胞活性检测 本实验所用细胞均以台盼蓝染色排阻法测定活率,只有活率大于90 %才用于实验。 以不同浓度外源性氧自由基发生系统作用后(分组见后) ,取各组细胞培 养基上清011 ml ,测定台盼蓝摄取率,并依Bradford8法定蛋白,参照Wroblewski9的方法 测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase , LDH) ,作为细胞受损指标。116 细胞膜流动性的测定 贴壁生长的细胞经胰酶消化后制成细胞悬液,加入二苯基己三烯(diphenyl hexatriene , DPH)使终浓度为210- 6mol/L , 25 孵育30 min , 1 000 r/ min 离心5
10、 min ,收集细胞沉淀,以3 ml PBS (pH 714)制成悬液,用荧光分光光度仪(MCF24 , Hi2tachi公司生产) ,在362 nm激发波长、432 nm发射波长下测定荧光值。117 细胞周期的测定 贴壁生长的细胞经胰酶消化后制成细胞悬液并计数细胞。 取1ml样品(细胞106个) ,以215倍体积无水乙醇于- 20 过夜固定, PBS (pH714)洗3遍,将细胞定容在1 ml PBS。 加入100l RNase A (10 ng/ ml) ,在37 孵育30 min ,加50l碘化丙 锭(PI)染色,以流式细胞仪(Becton genomic DNA of VSMC/ XM
11、62SOD (lane 4) was digested by Xba + Hind, Northern blot with hSOD1probe (right , upper) and 18S RNA probe (right , lower) : VSMCs (lane 1) , VSMCs/ XM6 (lane 2) and VSMCs/ XM62SOD (lane 3) .图 3 不同浓度外源性氧自由基作用后细胞LDH的释放量 Fig13 Effects of different concentrations of exogenous oxygen2free eadicals (OFRs
12、)on LDH release The OFRs were generated by X/ XO system. The con2 centrations of XO correspondent to various X values were 1 , 5 , 10 , 20 , 50 and 100 IU/L , respectively. Data are shown asxsx.3P 0105;33P 0101; 333P 01001vsVSMCs group (ANOVA) .图 4 不同浓度外源性氧自由基作用后的细胞胎盘蓝摄取率 Fig14 Effects of different
13、concentrations of exogenous OFRs on cellular trypan blue uptake rate The generation of OFRs and combination dosage of X/ XO were the same as in Fig13. Data are shown asxsx.3P 0105;33P 0101;333P 01001vs VSMCs group (ANOVA) .202生 理 学 报 51卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights
14、reserved.图 5 不同浓度外源性氧自由基作用后细胞膜流动性改变 Fig15 Effects of different concentrations of exogenous OFRs on cell membrane fluidity The OFRs were generated by X/ XO sys2 tem. The combined concentrations of X/ XO were 0/ 0 , 0105/ 5, 011/ 10( Xmmol/L vs XO IU/L) . Data are shown asxsx.3P 0105;33P 0101;333P0100
15、1vsVSMCs group (ANOVA) .度为0103 mmol/L和3 IU/L) , 2、12、24和48 h后收集细胞,以流式细胞仪测定S期细胞比率。 结果如表1所示。 氧自由基刺激后48 h内,两组细胞S期比率均升高,提示细胞内DNA合成增加,细胞呈增殖反应。 但是,转化VSMCs组S期细胞比率增高幅度明显不及对照组VSMCs。 时至48 h转化VSMCs组S期细胞比率仅比刺激前升幅近70 % ,而对照组则升幅达350 % ,具有明显统计学差异。 本结果说明,转化hSOD1的VSMCs具有抗低剂量外源性氧自由基的促增殖作用。表1 外源性氧自由基对细胞S期比率的影响Table 1
16、Effects of exogenous OFRs on cell S phase ratio (x %sx)Time / hS phase ratio VSMCsVSMCs / SOD0719219711217229112129132191231181161613114244313211261211948291921812122193 讨论本实验将hSOD1基因导入VSMCs后,观察其抗氧自由基损伤作用,目的在于探讨通过局部表达某些特异性保护蛋白基因(如SOD ,过氧化物酶, MAO等) ,进行As基因治疗的可行性研究。以逆转录病毒为载体构建重组基因,再经包装细胞PA317包装,产生具有攻击增殖旺盛靶细胞的重组病毒颗粒,几乎成了目前基
