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1、1 核酸的结 构与功能1.1 核酸的种类、分布和化学组成1.2 DNA的结构1.3 RNA的结构1.4 核酸的性质1.4 核酸的性质 p169一、核酸的溶解性质二、核酸的紫外吸收特性三、核酸的沉淀特性和浮力密度四、DNA的变性与复性五、两性解离性质六、核酸的水解一、核酸的溶解性质微溶于水，不溶于有机溶剂（乙醇、氯仿）DNP(DNA-蛋白质)溶于高盐溶液(1molL-1NaCL)RNP溶于低盐溶液二、核酸的紫外吸收特性 p170/141l在核酸分子中，一般在260nm左右有最大吸收峰嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系核酸及其组份定性和定量测定的依据l蛋白质（酪氨酸和色氨酸）的最大吸收在280nmDN
2、A的紫外吸收特性的应用1. DNA或RNA的定量 A260=1相当于 50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA 20g/ml 寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: A260/A280 = 1.8 RNA纯品: A260/A280 = 2.01.8，含RNA 环状DNA线状DNA蛋白质 DNA中G-C越多，密度越大 核酸变性,浮力密度变大：线形致密 线团2、浮力密度(Buoyant Density)Density gradient centrifugation密度梯度离心 The relationship of the densities (in g/mL) of DN
3、As from various sources and their G : C content肺炎球菌沙雷氏菌鲑鱼精子 草分支杆菌 小牛胸腺 四、DNA的变性 与复性 p1711、DNA的变性 (DNA denaturation)概念核酸的变性指核酸 双螺旋的氢键断裂，变 成单链，并不涉及共价 键的断裂。DNA变性的本质双链间氢键的断裂 ，破坏了核酸的空间结 构，但不涉及一级结构 （共价键）的断裂。Partially denatured DNA变性因素过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、甲醛等变性后理化性质变化：紫外吸收增加（增色效应） 粘度下降 比旋度降低 沉降系数加大 浮力密度增高 生物活性
4、部分或全部丧失 例：变性引起紫外吸收值的改变DNA 的 紫 外 吸 收 光 谱增色效应(hyperchromicity)：含DNA和RNA的溶液经变性或降解后对紫外线吸收的增加。是由于碱基之间电子 的相互作用的改变所致，通常在260nm测量。减色效应(hypochromicity)：层叠碱基间的电子间相互作用使得单个碱基的吸光度减弱；与未层叠状态相比 其全部吸光度减弱40%。聚集碱基消光系数的下降即为。 Tm值概念：DNA热变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半 ）时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度（
5、melting temperature），用Tm表示。A、DNA的均一性均一性愈高的样品，解链温度较窄。B、G-C含量G-C含量高的DNA，Tm值也高X(G+C)=(Tm-69.3) 2.44Tm=69.3 + x(G+C) 0.41C、介质离子强度离子强度增大，DNA的Tm随之增大，解链温度范围则较 窄;离子强度较低，DNA的Tm较低，解链温度范围较宽。（DNA样品在1molL-1氯化钠溶液中保存较为稳定）影响因素介质离子强度对Tm的影响肺炎球菌G+C百分含量对Tm的影响草分支杆菌 粘质沙 雷氏菌 柠檬酸Na2、复性(Renaturation) p173变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此
6、分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程为复性。热变性后的复性又称为退火（Tm-25）。概念成核拉链式影响复性速度的因素DNA的浓度DNA浓度直接影响到DNA单链间碰撞的几率，DNA浓度越大，复性速度越快。 DNA的分子量 大分子量的DNA扩散速度较慢，也难于形成正确配对，因此复性速率较慢。温度温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；温度过低，则少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续 寻找正确配对。适宜的复性温度是较Tm值低25 离子强度过低，不利于复性。离子强度DNA总量一定时，基因组越复杂，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。 DNA分子的复杂性3、核酸杂交（Nucleic A
7、cid Hybridization ）p175应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片断按碱基互补关系形成杂交双链分子，这一过程称为核酸的分子杂交。概念DNA hybridizationDNA杂交应用核酸探针是指特定的已知碱基序列的核酸片断，可以是DNA、cDNA、mRNA及RNA等。lSouthern 杂交（Southern blotting）DNA-DNA 杂交 lNorthern 杂交（Northern blotting）DNA-RNA杂交lWestern 杂交 （Western blotting）蛋白质杂交分子杂交的原理示意图杂交DNA的热变性 冷却复性Sout
8、hern HybridizationSouthern 印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记 DNA探针杂交放射自显影带有DNA片 段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液 转移DNA吸附有DNA 片段的膜Polymerase chain reaction(PCR)4、聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction (PCR) 4、Polymerase Chain Reaction (PCR) 反应体系：模板核酸引物dNTPTaqDNA聚合酶缓冲溶液Mg2+反应程序：变性温度退火温度（Tm-25）延伸温度和时间循环次数五、两性解离性质核酸是两性电解质，
9、（含碱性基团、磷酸基团），因磷酸的酸性强，常表现酸性。（核苷酸的解离性质 p142-143）由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳（琼脂糖、聚丙烯酰胺）。凝胶中加入溴乙锭（EB），分离的核酸条带在紫外光下发出荧光。六、核酸的水解1. 酸水解RNA对烯酸不敏感。DNA嘌呤碱基所连接的C-N键在1mol/L的盐酸溶液中很容易被水解，释放出嘌呤碱，生成脱嘌呤酸。2. 碱水解DNA对碱稳定。 RNA对碱敏感。在稀碱溶液中很容易被水解，得到2,3-核苷酸混合物。（1 1）化学裂解法：）化学裂解法：MaxamMaxam /Gilbert /Gilb
10、ert法法（2 2）链终止法：链终止法：Sanger法DNA测序（1）Maxam-Gilbert method for DNA sequencing 将DNA的末端之一 进行标记(通常为 放射性同位素32P）在多组互相独立的 化学反应中分别进 行特定碱基的化学 修饰，产生一系列 长度不一而5端被 标记的DNA片段聚丙烯酰胺凝 胶电泳将DNA链 按长短分开,根 据放射自显影 显示区带，直 接读出DNA的核 苷酸序列。（2）DNA sequencing by the Sanger method（2）DNA sequencing by the Sanger methodDNA sequencing
11、by the Sanger methodThe chain terminat ion or dideoxy method of DNA sequenci ngStrategy for automating DNA sequencing reactions毛细管凝 胶电泳荧光Isolation of eukaryotic mRNA via oligo(dT)- cellulose chromatography有一个DNA双螺旋分子，其相对分子量为3107，求（1 ）分子的长度？（2）分子含有多少螺旋？（3）分子的 体积是多少？（脱氧核糖核酸碱基对的平均分子量为 618）。 （1）分子长度 = （
12、3107/618） 0.34 = 16505nm （2）分子含螺旋数 = 3107/61810=4854 或 16505/3.4 （3）分子体积 =R2h =（1nm）2 16505nm =51825.7nm3计算一段双链DNA包含1000个碱基，其组成中G+C占58%， 那么在DNA的该区域中胸腺嘧啶残基有多少？1、DNA样品制备过程中进程混入RNA，想通过A260/A280 的数值来推算DNA的纯度。已知纯DNA的A260/A280比值 为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0，纯DNA的A260为1 时的浓度为50ug/ml,纯RNA的A260为1时的浓度为 40ug/ml。要确保DNA的纯度大于90，试问A260/A280 不得大于多少？2、列举可以鉴定出RNA样品中是否混入少量DNA的三种 实验方法。
