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1、基因敲除Knock Out背景介绍1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组同源重组Homologus Recombination n同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段 设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组 同源重组示意图同源重组示意图一、Cre/Loxp
2、系统nCre重组酶（37）位点特异性重组酶，介导loxp位点间的序列同源重组70%重组率，无需辅助因子，多种结构的DNA底物nLoxp site34bp反向重复序列nFlp/Frt重组系统P1噬菌体（1）重组方式（2）基因敲除机理Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation基因敲除机理 （续）Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation二、基因敲除的基本流程（1）打靶载体构建Conditional KnockoutExon13NGT/AGAttention:（2）转化E
3、S细胞电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞电转需要的细胞数量2-5x107（3）阳性克隆筛选随机整合定点整合没有整合DTA(白喉毒素A亚基） （4）囊胚注射小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞（5）嵌合体小鼠（6）品系纯化Loxp2小鼠品系建立完成纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种三、Cre工具鼠的构建DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulate
4、d and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001). MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)MerCreMer融合蛋白该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。 The End
