饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响

《饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响饲喂抗生素对猪肠道内微生物群系的影响周勇（译）周勇（译）摘要：摘要：抗生素在农业型动物上的使用已有超过 50 年的历史，其有助于对动物疾 病治疗、疾病预防以及促进其生长。然而这类抗生素的应用对人类疾病治疗的 影响是一个激烈争论的话题。本实验在高度控制的环境条件下对猪进行饲养试 验，同一窝猪仔选择一部分饲喂含有高性能抗生素（金霉素、磺胺甲嘧啶和青 霉素，被称为 asp250）的饲料，另一部分用不添加抗生素的相同的饲料饲喂。 我们采用系统发育

2、学，基因组分析，以及定量 PCR 的方法，来处理抗生素对猪 肠道微生物的影响结果。14 天后添加抗生素处理的菌群类型发生转变，饲喂药 物的猪肠道内的有益菌的数量比不含药物的增加（1-11%） 。这种转变是由于大 肠杆菌的数量增加。宏基因组的分析表明，在饲喂抗生素的猪体内，微生物所 含有的与能量产生和转化有关的功能基因增加。探究结果还表明，没有饲喂药 物的猪内也具有较高的抗生素抗性基因，但饲喂药物的猪体内抗生素抗性基因 的丰富性和多样性都增加。一些丰富的基因如氨基糖苷类的 O磷酸基转移酶 对试验中没有使用的抗生素也产生抗性。这表明，其对没有被饲喂的抗生素有 间接选择的潜力。抗生素亚治疗剂量饲喂的

3、副作用是明显的，并且必须考虑对 成本效益分析。关键词：肠道菌群，微生物组转化，猪肠道内细菌，关键词：肠道菌群，微生物组转化，猪肠道内细菌，Bio Trove 芯片，基因组分芯片，基因组分 析。析。在传统的农业饲养技术中，抗生素是维持或改善动物健康和饲料转化率的 最具成本效益的一种方式。除了提高饲料的转化率外，抗生素也普遍用于牲畜、 家禽以及鱼类的疾病治疗和预防。据报道，农业使用的抗生素总量占据美国各 类抗生素生产总量的一半。尽管抗生素的使用对农业的作用非常明显，但是抗 生素的滥用以及动物和人类病原菌对多种抗生素的抵抗性的迅速、普遍的出现， 已经使人类对当前抗生素的使用产生质疑。对环境和肠道微生

4、物群落的研究揭 示了抗生素抗性基因的丰富多样性。添加抗生素进行饲喂，提供了一种选择压 力，这可能导致牲畜体内共生的生物群落产生持续的变化。此外，抗生素抗性 基因的存在已被证明在细菌群落中是稳定的，即使在没有抗生素的情况下也存 在。对抗生素抗性基因丰富性增加的主要担心是抗性基因向病原体中的转化。 因此，食品和药物管理局最近发布了一份草案，建议限制抗生素在畜牧业的使 用。而美国社会传染病监测机构早在国会委员会通过之前就支持这种限制。动物肠道内定居的细菌对维持宿主的健康有重要作用。肠道微生物有助于 宿主对营养物质的吸收，增强宿主免疫系统并促进肠道上皮细胞的形成，是一 个抵抗病原体的天然防御系统。然而

5、和这些好处相反，肠道菌群有可能通过远缘生物进行抗性基因的扩散， 对将来的治疗产生抗性。例如，人类结肠癌细胞中的共生细菌藏有抗生素抗性基因，且能够将这些基因转移给病原体。事实上，水平基因转移在很大程度上 是由革兰氏阴性菌的多重耐药性引起的。随着对人类食物链中所含共生菌中的 抗生素抗性基因的确定，作为动物和食源性致病菌的抗性基因储存者的肠道微 生物，其作用需要进一步探索研究。通过培养和 PCR 方法对狭窄组的细菌或基因组进行研究，已经获得了一些 有价值的见解，如猪体内分离的红霉素抗性基因；然而，每日饲喂压剂量的抗 生素对牲畜体内的微生物的综合作用还没有研究。因此，我们试图对饲喂抗生 素对整个肠道内

6、微生物群系的影响进行一个广泛性的评估。 采用种群类型分析、宏基因组学和平行定量 PCR 追踪微生物菌株间和编码 功能的变化，有利于对所谓的抗生素的副作用效果的检测（也就是促进生长和 预防疾病之外的其他效果） 。这些负效应包括大肠杆菌的数量增加和抗生素抗性 基因丰度的增加。仔猪在艾姆斯IA 国家动物防疫中心出生，并在高度控制和净化的室内饲 养，避免加药动物、非加药动物和栏里面的其他动物发生药物之间的交叉污染。 无论仔猪还是母猪实验之前都没有接触抗生素。这种设计是为了确保从母体获 得同水平的仔猪，最大限度的减少变异，使抗生素治疗的效果能够被检测。在 18 周龄时，同窝猪仔的一组饲喂 ASP250

7、饲料（含有药物） ，另一组饲喂未修饰 的饲料（不含药物） ，饲喂 3 周。ASP250 是一种抗生素类的饲料添加剂，含有 金霉素、磺胺、青霉素，通常用于猪细菌性肠炎的治疗和提高饲料转化效率。 采集处理前 0 天和处理后 3，14 和 21 天的粪便样本。0 天样本用来描述抗生素 治疗以前的猪肠道内微生物群系。 结论：结论：饲喂饲喂 ASP250 的微生物区系成员的转变的微生物区系成员的转变。从 12 份粪便样品中，分离 16S rRNA 基因中 V3 区的 133，294 序列。对相同处理和取样日期相同的猪的数据 进行分组，评价抗生素对群系微生物成员的作用效果。据哺乳动物肠道环境的 报道和最新

8、的宏基因组学研究，大部分可分类的序列，属于拟杆菌、厚壁菌以 及变形菌群（如表 S1） 。拟杆菌中的普雷沃菌属一贯丰富，作为猪体内微生物 组特征的展现。用布雷斯柯蒂斯指数对所有样品进行组合计算和相似性分析。 对这些数据进行非度量多维尺度（NMDS）的绘图表明饲喂 14 天的样本与 0 天 的样本 (P0.05） 。 误差线代表误差线代表SEM。(C) 依据对耐药性基因丰度的依据对耐药性基因丰度的qPCR的数据计算的数据计算Bray-Curtis相似性系数相似性系数 并绘制多维尺度图。点与点之间的距离，表明样品间抗性基因的多样性的差异程度。样本并绘制多维尺度图。点与点之间的距离，表明样品间抗性基因

9、的多样性的差异程度。样本 离群值（方形）来自于第离群值（方形）来自于第21天药物处理猪。天药物处理猪。0天样品的测量不显示。天样品的测量不显示。Table 1. 处理期间，用宏基因组处理期间，用宏基因组每个耐药基因在宏基因组中的序列号：药物处理每个耐药基因在宏基因组中的序列号：药物处理（n=1）VS 非药物处理（非药物处理（n=3）和和qPCR基因拷贝数基因拷贝数/16S rRNA的基因拷贝数的基因拷贝数检测药物处检测药物处 理和非药物处理的猪的粪便样本中耐药性基因的差异描述理和非药物处理的猪的粪便样本中耐药性基因的差异描述(P 0.05)。 通过qPCR检测ASP250处理增加了抗性基因类型

10、的多样性香浓指数1.4（药物处 理） ，0.8（无药物处理)，P=0.04。采用t检测法对14天药物处理样品的宏基因组 与相应的无药物处理的宏基因组中抗性基因的平均数量的比较证实了这一结论 （P0.05） 。此外，抗性基因区的结构被抗生素改变，可由Bray-Curtis的双向 ANOSIM（P0.01）确定。然而，对照R值是0.25，表明分离程度是有限的。不 过，用ASP250 处理抗性基因的多样性比较集中，可能是因为抗生素的选择压 力（如图2C） 。综合起来看，这些结果表明喂养抗生素可增加个体样品中抗性 基因的得多样性以及均质化，均质化即为不同处理样品间的多样性。 讨论讨论采用种群型、宏基因

11、组学和qPCR方法评估了ASP250对猪体内抗生素抗性 基因的作用。结果表明猪体内的肠系微生物具有潜在的抗性基因，即使在没有 选择压力的条件下也是如此。特别是有五个基因，在饲喂药物和无药物饲喂的 样品的微生物群系中都能高频率检测。这些基因可能代表了这批猪的核心抗生 素抗性基因组。事实上，这表明tet在农场动物中含量丰富，我们的数据支持了 的结论。饲喂抗生素产生持续的选择压力50y已经在猪肠道菌群里建立了一个抗 性的高背景水平。即使在抗性较高的背景下抗生素的处理也能增加抗性基因的 丰度，其中许多可能是因为与ASP250中的抗生素直接作用而变得丰富。例如， 磺胺二甲嘧啶可能是磺胺抗性基因 sul2

12、 or sul1，饲喂药物的动物样品中九个中 有八个都能检测到。此外，在饲喂药物的动物中A类-内酰胺酶过度表达并使 其获得抗性，可以裂解-内酰胺抗生素如青霉素。许多其他丰富性抗性基因的 功能是通过向外输出化学物质。这些外流物质包括但不限于抗生素，也可能是 缺少具体的抗性基因但能在抗生素压力下生存的细菌。多药物的外排往往伴随 着令人担忧的多耐药性医疗问题以及可转移基因因素的出现。除了对特定的基 因家族的影响，饲喂抗生素的同类中，个体的抗性基因的丰富性随着时间的推 移增加。尽管整个样品中有大量的抗性基因异质性，但当前的研究深度可以使 这些有趣的现象可视化。尽管他们没有赋予其中抗生素的抗性，但使用A

13、SP250 喂养，氨基糖苷类O-磷酸转移酶类型的抗性大量增加。在药物喂养的猪宏基因 组中，13个已被鉴定的磷酸转移酶中的10个和大肠杆菌O86:H- (accession number YP_788126).的pO861质粒上链霉素磷酸转移酶基因同源（70%的氨基酸 完全一致） 。在选择压力（30）下，抗性基因在质粒上集中分布，pO86A1至少 携带两个其他的抗性基因（编号为NC_008460） 。在可动遗传因子 上这些抗性 基因的聚集体能够为细菌生存提供最适应的有利条件，在持续有抗生素存在的 情况下。然而，这是喂养抗生素的一个不需要的副作用，因为这些抗性基因簇 在猪肠道内或农业环境中能够转移

14、给大肠杆菌或其他人类的病原菌中。选择机 制和结果表明抗生素的使用增加了针对性抗性基因的丰度，超越了对来自于猪 肠道菌群不同背景的抗生素抗性基因的抗生素的管理，这增加了可检测性，即 使在抗性基因多样性的高背景下。抗生素的副作用超出了抗性基因的影响。COGs对猪肠道菌群的统计分析表 明，基因编码的毒性、基因转移以及能量的产生和转化功能通过饲喂抗生素选 择。具体的过度表达COGs包括一些与P菌毛装配有关的基因，P菌毛为大肠杆 菌的附属物和毒性物质。另外，COGs在药物处理的额宏基因组的作用还包括易 位酶，参与抗性基因的转移。这些功能可以提高耐药基因在微生物群落中的稳 定性和传播。此外，编码能量产物和

15、功能转化基因的丰度的增加可能是因为一 些抗生素的促生长特性，需要进一步实验对其检测。在农业动物饲养中，认为 抗生素的主要作用是通过减少菌量提高饲料转化率，通过减少对营养的竞争对 宿主有利，减少宿主对微生物响应的成本。抗生素处理后，对猪的代谢进行分 析表明，饲喂抗生素对多种合成途径有作用，包括糖、脂肪酸、胆汁酸、类固 醇激素的合成。因此，COGs可能是一个有用的标识，用于识别微生物及其功能 对抗生素如ASP250促生长作用的重要性。微生物功能的变化导致微生物菌群成员的变化令人关注的是成员关系的转 化已经被检测。在处理的动物体内，拟杆菌门的减少可能是由于使用ASP250作 为饮食饲喂猪促进生长的好

16、处。与瘦的小鼠相比，胖鼠粪便内的拟杆菌相对于 厚壁菌来说含量较低。可能是因为这种改变，胖鼠体内的能量吸收能力提高， 也许这种转变也与猪体内饲料的转化改善有关。此外，在哺乳动物的肠道菌群 中，口服抗生素治疗普遍引起了大肠杆菌的增加，已经报道的有阿莫西林，甲 硝唑和铋，甲硝唑，万古霉素，亚胺培南。然而，阿莫西林加上-内酰胺类抑 制剂克拉维酸通过饲喂和注射都会导致猪体内大肠杆菌数量的减少，在人类治 疗期内口服环丙沙星可造成变形杆菌种群数量下降。这些结果对不同抗生素产 生不同的副作用来说是一个重要的提示。大肠杆菌是哺乳动物胃肠道内共生的 且是治病的细菌，无论对宿主还是在食物链中，数量的增加可能是有益的也可 能是有害的。此外，大肠杆菌数量的增加与孕妇体重的过度增加有关，这是对 宿主产生的不利的作用结果，但是同样在牲畜体内这类菌是一个潜在的促生长 作用。因此，一个理想的结果必须仔细的权衡使用抗生素的成本和效益。微生物群落间罕见的成员之间在处理和控制之间的差异缺少理解，有待进 一步的调查研究。这些细菌在处理作用下增加，栖热球菌门的成员是已知的耐 环境