氨基酸药物的发酵生产

《氨基酸药物的发酵生产》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氨基酸药物的发酵生产（84页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第一节 氨基酸类药物的基本概念一、氨基酸类药物的基本知识从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，但是 参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有二 十种。1986年发现第21种 硒代胱氨酸 最近发现第22种 遗传基因编码的氨基酸 吡咯赖氨酸。180多种天然氨基酸大多数是不参与蛋白质组成的 ，这些氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。氨基酸是构成机体蛋白质的基本单位，且构成生 物体蛋白质的氨基酸都是-氨基酸，除甘氨酸外，- 碳原子均为不对称碳原子，具有立体异构现象，均是L -型氨基酸。1、分类：（1）根据氨基酸在pH5.5溶液中带电状况分为酸性 、中性及碱性氨基酸三类。（2）依R基团差异亦分为：脂肪族

2、氨基酸、芳香族氨基酸及杂环氨基酸三类其中L-组氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸及L-羟脯氨酸 为杂环氨基酸，L-酪氨酸及L-苯丙氨酸为芳香族氨基酸，其余均为脂肪族氨基酸。2、性质：（1）物理通性：天然氨基酸纯品均为白色结晶性粉末，熔点及分 解点均在200以上。在有机溶剂中溶解度一般较小。均为两性电解质，各有一定等电点。除甘氨酸外 都有旋光性。氨基酸能使水的介电常数增高,而一般的有机化合 物乙醇、丙酮等却使水的介电常数降低。是以离子晶 格组成，而一般的有机化合物是由分子晶格组成的。（2）化学通性：-氨基酸共同的化学反应有两性解离及林海定反应 (ninhyding reactiong) 、酰化、烷基化

3、、酯化、酰氯 化、酰胺化、叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽键结合反 应及与甲醛和亚硝酸的反应等。特殊基团反应：酪氨酸的酚羟基可产生米伦反应与福林达尼斯反 应；精氨酸的胍基产生坂口反应；色氨酸的吲哚基与芳醛产生红色反应；组氨酸的咪唑基产生Pauly反应；苯丙氨酸硝化后于碱性条件下产生桔黄色反应；胱氨酸及半胱氨酸经酸或碱破坏后可与醋酸铅产 生铅黑反应；半胱氨酸在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠（硝普盐 ）反应生成紫红色化合物。色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光谱 ，色氨酸最大吸收波长为279nrn，苯丙氨酸为259nm ，酪氨酸为278nm。但构成天然蛋白质的20种氨基酸 在可见光区均无吸收。 氨基酸

4、的上述理化性质是蛋白质与氨基酸合成、转 化、分离纯化及定性定量检测的依据二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用1、氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，故生物体 中众多蛋白质的生物功能，无不与构成蛋白质的氨基 酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密 切的关系。因此氨基酸对维持机体蛋白质的动态平衡 有极其重要的意义。生命活动中人及动物通过消化道 吸收氨基酸 。通过体内转化而维持其动态平衡，若其动态平衡失 调，则机体代谢紊乱，甚至引起病变。2、许多氨基酸尚有其特定的药理效应。 （）氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系氨基酸为构成天然蛋白质的基本单位，故蛋白质营 养价值实际是氨甚酸作用的反映。健康人

5、靠膳食中的 蛋白质获取各种氨基酸满足机体需求。缺乏蛋白质则 影响机体生长及正常生理功能，抗病力减弱引起病变 。消化道功能严重障碍者及手术后病人常因禁食无法 获得足够蛋白质，自身蛋白质过量消耗，致使营养不 良而导致病情恶化或预后不良。临床上常通过直接输入氨基酸制剂改善患者营养 状况，增加治疗机会，促进康复。赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等8种氨基酸必需氨基酸：人及哺乳动物自身不能合成，需由 食物供应。 半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分 别由其他氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)产生，若食物中 提供了足够的该氨基酸（氨酸及酪氨酸），可减少对 其他氨基酸（蛋氨

6、酸及苯丙氨酸）的需求量。氨基酸（精氨酸及组氨酸）合成速度较低，通常 难以满足需求，需由外界补充一部分。（二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物（三）治疗肝病的氨基酸及其衍生物（四）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物（五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物（六）其它氨基酸类药物的临床应用第二节 氨基酸类药物的生产方法1、 目前全世界天然氨基酸的年总产量在百万吨左 右，其中产量较大者有谷氨酸、蛋氨酸及赖氨酸，其 次为天门冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它们主要用 于医药、食品、饲料及化工行业中。2、 目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法 有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成 法等四种。3

7、、 氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主 要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐 等化学方法或酶转化法生产。一、水解法（一）基本原理与过程 以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸 、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得 各种药用氨基酸的方法称为水解法。目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨 酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及 L-丝氨酸等。水解法生产氨基酸的主要过程为水解、分离和结 晶精制三个步骤。1、蛋白质水解方法目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水 解法三种。 （1）酸水解法 蛋白质原料用610molL盐酸或 8molL硫酸于11

8、0120（回流煮沸）水解12 24h，除酸后即得多种氨基酸混合物。此法优点是水 解迅速而彻底，产物全部为L-型氨基酸，无消旋作用 。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被 破坏，且产生大量废酸污染环境。（2）碱水解法 蛋白质原料经6molL氢氧化钠或 4molL氢氧化钡于100水解6h即得多种氨基酸混 合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但 含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用 。工业上多不采用。（3）酶水解法 蛋白质原料在一定pH和温度条件下经 蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水 解法。此法优点为反应条件温和，无需特殊设备，氨基 酸不破坏，无消旋作用。缺点

9、是水解不彻底，产物中 除氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产 氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。2、氨基酸分离方法氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉 淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。（1）溶解度法 是依据不同氨基酸在水中或其它溶剂 中的溶解度差异而进行分离的方法。胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸 溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，故可将混合 物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分开。（2）特殊试剂沉淀法 系采用某些有机或无机试剂与 相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。如邻二甲苯-4-磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀 ，后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸

10、；组氨酸可与HgC12形成不溶性汞盐沉淀，后者经 处理后又可获得游离组氨酸；精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸 沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。（3）吸附法 是利用吸附剂对不同氨基酸吸附力的差 异进行分离的方法。如颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨 酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸 附力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来 。（4）离子交换法 是利用离子交换剂对不同氨基酸吸 附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质 ，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态 不同，故同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不 同。3、氨基酸的精制方法分离出的特定氨基酸中常含有

11、少量其它杂质，需进 行精制，常用的有结晶和重结晶技术，也可采用溶解 度法或结晶与溶解度法相结合的技术。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0， 故丙氨酸可在pH6.0时，用50冷乙醇结晶或重结晶 加以精制。溶解度与结晶技术相结合的方法精制氨基酸。如在 沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若将含少 量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍体积（wv）的热 水中，调pH4.0左右，经脱色过滤可除去大部分酪氨 酸；滤液浓缩至原体积的13，加2倍体积（vv） 的95乙醇，4放置，滤取结晶，用95%乙醇洗涤，烘干即得苯丙氨酸精品。（二）用水解法生产氨基酸的品种及工艺绝大多数氨基酸均可采用酸水解法生

12、产，但目前由 于发酵方法及酶工程技术的迅速发展，仅有几种氨基 酸仍采用酸水解法生产。现胱氨酸及亮氨酸生产为例 。1、L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制备 （1）L-胱氨酸的结构与性质 L-胱氨酸存在于所有蛋 白质分子中，尤以毛、发及蹄甲等角蛋白中含量最多 。其分子由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成，结构为： L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶体，分 解点258261，pI为5.05，25D 为-232。在 25水中溶解度为0.011，在75水中为0.052。溶于 无机酸及无机碱，在热碱液中可被分解。不溶于乙醇 、乙醚及丙酮。可被还原为L-半胱氨酸。（2）工艺路线 （3）工艺过程

13、水解 110117水解7h（自100时计）后出料,玻 璃布过滤,收集滤液。中和 直至pH4.8，静置36h，涤纶布滤取沉淀，离心 甩干得L-胱氨酸粗品。粗制 升温至6570，搅拌半小时，加活性炭16kg ，于8090保温半小时，滤除活性炭。调滤液至 pH4.8，静置结晶，吸出上清液后，底部沉淀经离心 甩干得胱氨酸粗品（）。 精制 中和 升温至70，加活性炭1.52.5kg，85 搅拌半小时，过滤，加1.5倍体积蒸馏水，升温至75 80，搅拌下用12氨水（化学纯）中和至pH3.5 4.0，析出结晶，滤取胱氨酸结晶，蒸馏水洗至无 氯离子，真空干燥得L-胱氨酸成品。（4）检验 应为六角形或六角柱形白

14、色结晶，含量在 98.5以上，干燥失重小于0.5，炽灼残渣小于0.2 ，氯化物小于0.15，铁盐小于0.001，重金属小 于20ppm。含量测定：（5）作用与用途 L-胱氨酸具有增强造血机能、升高 白细胞、促进皮肤损伤的修复及抗辐射作用。临床上 用于治疗辐射损伤、重金属中毒、慢性肝炎、牛皮癣 及病后或产后继发性脱发。2、L-亮氨酸（L-Leucine，L-leu）的制备（1）L-亮氨酸的结构与性质 L-亮氨酸存在于所有蛋 白质中，以玉米麸质及血粉中含量最丰富，其次在角 甲、棉籽饼和鸡毛中含量也较多。L-亮氨酸为人体必 需氨基酸之一，化学名称为2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨 基异己酸，分子式：C

15、6H13NO2,分子量：131.17 ,结构 式： L-Leu自水及乙醇中得白色片状结晶，pI为5.98 ，熔点为293，在25水中溶解度为2.19，乙醇中为 0.017;在75水中为3.82，在醋酸中为10.9，不溶于乙 醚。（2）工艺路线：（3）工艺过程：水解、赶酸 取6molL HC1 500L于1吨水解罐中， 投入100kg动物血粉，110120回流水解24h后，于 7080减压浓缩至糊状。加50L水稀释后，再浓缩 至糊状，如此赶酸三次，冷却至室温滤除残渣。吸附、脱色 上述滤液稀释1倍后，以每分钟0.5L的 流速流进颗粒活性炭柱（30180cm）至流出液出现苯 丙氨酸为止，用去离子水以

16、同样流速洗至流出液pH4.0 为止，穿柱液与洗涤液合并。浓缩、沉淀与解析 上述流出液减压浓缩至进柱液体 积的13，搅拌下加入110体积（vv）的邻二甲 苯-4-磺酸，产生亮氨酸磺酸盐沉淀。滤取沉淀并用2 倍体积（wv）去离子水搅拌洗涤两次，抽滤压干得 亮氨酸磺酸盐。滤饼加2倍体积（wv）去离子水搅 匀，用6mol/L 氨水中和至pH68，7080保温搅 拌1h，冷却过滤。沉淀用2倍体积（wv）去离子水 搅拌洗涤两次，过滤得亮氨酸粗品。精制 L-亮氨酸粗品用40倍体积（wv）去离子水 加热溶解，加0.5活性炭于70搅拌脱色1h，过滤， 滤液浓缩至原体积的14，冷却后即析出白色片状亮 氨酸结晶。过滤收集结晶，用少量水洗涤、抽干，70 80烘干得L-亮氨酸成品。 （4）检验 应为白色片状结晶，含量98.5101.5% ，干燥失重不超过0.2，炽灼残渣不超过0.4，氯 化物不超过0.0